AP系列-Day2-定量分析流程与Analyst软件

Analyst®软件介绍2©2012ABSCIEX基础应用培训Analyst®软件界面模块（Mode）列表项目（Project）目录导航栏仪器状态栏3©2012ABSCIEX基础应用培训Analyst®软件版本信息点击菜单中的Help→AboutAnalyst，在如右图的弹出窗口中可读出软件版本号Analyst目前的主要版本有1.5系列（包括1.5、1.5.1和1.5.2）和1.6系列（包括1.6、1.61和1.62）1.5和1.6的主要差别在于前者只支持WindowsXP（SP3）后者完全支持Windows7操作系统4©2012ABSCIEX基础应用培训软件模块Configure（配置），设置硬件、安全和报告配置TuneandCalibrate（调谐与校准），校准仪器和调谐方法Acquire（采集），设置采集方法和批文件的建立Explore（浏览），处理数据文件Quantitate（定量），数据定量5©2012ABSCIEX基础应用培训Configure（配置）模块Security（安全）6©2012ABSCIEX基础应用培训Configure（配置）模块Hardware（硬件）创建、编辑、删除仪器硬件配置文件激活、去激活仪器硬件配置文件7©2012ABSCIEX基础应用培训TuneandCalibrate（调谐）模块质量数校准优化质谱方法手动采集数据检测LC流速和背景点击“Acquire（采集）”将数据保存至选择的位置点击“Start（开始）”数据将以临时文件形式保存至D:\AnalystData\Projects\APIInstrument\TuningCache8©2012ABSCIEX基础应用培训TuneandCalibrate（调谐）模块质谱采样方法在Scantype中选择合适的采样方法9©2012ABSCIEX基础应用培训TuneandCalibrate（调谐）模块AdvancedMSSettlingtime:在experiments之间停顿的时间Pausebetweenmassranges:在扫描一段质量范围前的停顿时间Profile：stepsize=0.1amuFastProfile：stepsize=0.2amuCentroid：stepsize=0.3amuPeakHopping：stepsize=1amu可以输入其他数字10©2012ABSCIEX基础应用培训Acquire（采集）模块Batch（批文件）编辑器加入样品列表和样品信息选择方法和脚本选择样品位置(LC和MALDI)上交给列队11©2012ABSCIEX基础应用培训Analyst®文件存储位置D:\AnalystData\Projects\“Projectname”\“Subprojectname”请及时备份APIInstrument和默认的项目12©2012ABSCIEX基础应用培训Analyst®软件文件类型硬件文件*.hwpf采集方法*.dam数据文件*.wiff和*.wiff.scan采集批文件*.dab定量结果表文件*.rdb定量方法*.qmf13©2012ABSCIEX基础应用培训打开数据文件*.wiff文件从项目的数据文件夹中打开在一个数据文件中关联着多个样品或双击14©2012ABSCIEX基础应用培训浏览模块更多细节…..浏览选项不仅在菜单中也在工具栏中15©2012ABSCIEX基础应用培训打印4个选择打印栏（PrintPane）–打印正选中的栏打印窗口（PrintWindow）–一张纸上打印包含所有栏的窗口打印工作区间（PrintWorkspace）–在每个纸上打印所有的工作区间打印报告（PrintReport）–用报告的格式打印样品栏和样品信息定量分析流程简介17©2012ABSCIEX基础应用培训准备工作查阅文献、资料，获得目前化合物的分子式、结构式、溶解度等详细信息。维拉帕米：C27H38N2O4OONOONHM+nHz=454.2832+1.00741=455.3𝐷𝑎离子的质荷比，m/z18©2012ABSCIEX基础应用培训确定母离子的质荷比第一步，Q1SCAN使用50%甲醇水溶液（乙腈水溶液也可）配置适当浓度的标准溶液正离子化合物，可添加0.1%甲酸负离子化合物，无需添加激活MassOnly，双击运行ManualTuning使用针泵，以恒流方式进样根据待测化合物性质，选择分析的极性、离子化方式。也可实际进样测试之使用Q1Scan确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位（可适当平滑化）控制适当的浓度，尽可能使目标物的质谱峰响应值在1e6~3e6cps之间19©2012ABSCIEX基础应用培训确定母离子的质荷比第一步，Q1SCAN扫描范围100～MW+30，扫描速度约200Da/s找到目标化合物母离子仪器型号推荐的浓度（ng/mL）API32003200QTRAP500API40004000QTRAP200TQ4500QTRAP4500100~200TQ5500QTRAP550020~5020©2012ABSCIEX基础应用培训确定子离子的质荷比第二步，ProductIonScan得到高质量的MS2图设定CE初始值为5eV，以5eV为步长手动调节CE母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜可适当平滑后选择至少2~3个子离子，质荷比确定到小数点后一位也可另起一次采集，使用MCA累加质谱图21©2012ABSCIEX基础应用培训确定子离子的质荷比第二步，ProductIonScan找到合适的子离子手动调节CE22©2012ABSCIEX基础应用培训优化化合物参数第三步，MRM根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间，建议100ms用“Ramp”，优化CE（CollisionEnergy）与DP（DeclusteringPotential）以得到的参数初步建立MRM方法一般优化两次，以得到比较确切的结果23©2012ABSCIEX基础应用培训优化化合物参数第三步，MRM分别优化CE（CollisionEnergy）与DP（DeclusteringPotential）24©2012ABSCIEX基础应用培训优化化合物参数第三步，MRM在采集的数据中，找出每个MRM的最佳CE优化CE25©2012ABSCIEX基础应用培训优化化合物参数第三步，MRM找出最佳DP。一般，相同母离子的子离子，DP应为一致优化DP26©2012ABSCIEX基础应用培训采样方法建立第四步，MRMOnly将优化得到的DP参数输入Compound页下右键点击MRM列表区域，在弹出菜单中选择CollisionEnergy，点出CE列，输入对应MRM优化得到的CE参数保存采样方法27©2012ABSCIEX基础应用培训采样方法建立第五步，LC-MRM关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备单击Acquire中BuildAcquireMethod，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等设置色谱同步设置液相色谱参数流速、梯度、柱温、进样参数等等按下表推荐值设定离子源参数（Source）28©2012ABSCIEX基础应用培训采样方法建立第五步，LC-MRM推荐离子源参数英文名（简称）中文译名（单位）推荐值（4500和5500系列）低流速约5~100µL/min中等流速约200~600µL/min高流速800µL/min以上CurtainGas（CUR）气帘气（psi）15~2035~40$40$IonSprayVoltage（IS）离子化电压（V）[phone]+5500-4500+5500-4500Temperature（TEM）温度（℃）0450~550≥550IonSourceGas1（GS1）喷雾气（psi）15~2040~5555~70IonSourceGas2（GS2）辅助加热气（psi）040~6050~70InterfaceHeater（ihe）接口加热OnOnOnCollisionGas*（CAD）喷撞气MediumMediumMedium*不同扫描方式可能不同；$3200与4000系列调整为2529©2012ABSCIEX基础应用培训采样方法建立第五步，LC-MRM打开保存的MRMOnly方法1.点击+MRM（或其他相应的质谱模式）2.点击EditParameters3.在弹出窗口中，按图中所示设定默认的离子源参数12330©2012ABSCIEX基础应用培训岛津液相采样方法建立1.右键点击AcquisitionMethod，选择Add/RemoveDeviceMethod2.选择ShimadzuLCControllerMethod，添加液相3.选择LCSync液相同步触发质谱采样12331©2012ABSCIEX基础应用培训岛津液相采样方法建立（续）点击ShimadzuLCSystem在Pumps页面中设定液相基本参数流速初始梯度比例……32©2012ABSCIEX基础应用培训岛津液相采样方法建立（续）1.在Autosampler页面中设定进样参数，包括洗针条件等2.在Oven页面中设定柱温1233©2012ABSCIEX基础应用培训安捷伦液相采样方法设定1231.右键点击AcquisitionMethod，选择Add/RemoveDeviceMethod2.选择相应液相模块，添加液相3.选择LCSync液相同步触发质谱采样34©2012ABSCIEX基础应用培训安捷伦液相采样方法设定（续）流动相121.点击Run2.在LCPumpGradient中设定梯度列表3.在Limits（Advanced）中设定流动相335©2012ABSCIEX基础应用培训安捷伦液相采样方法设定（续）流动自动进样器与柱温箱1.点击Autosampler，在AutosamplerProperties中设定自动进样参数，包括洗针条件2.点击ThermostattedColumnCompartmentSL，在ColumnOvenProperties中设定柱温121236©2012ABSCIEX基础应用培训色谱条件优化第六步，LC-MRM接好并平衡色谱柱，用适当浓度标准品考察分离情况根据色谱分离情况，设定梯度洗脱MRM方式可以不必所有峰都基线分离，但要注意避开基质的干扰调整色谱流动相组成和流速，并相应调整源参数37©2012ABSCIEX基础应用培训色谱条件优化第六步，LC-MRM有机相(%)10903～5倍柱体积t1t2t32～5min多种因素影响T(min)基本色谱梯度038©2012ABSCIEX基础应用培训优化Source参数（可选）第七步，FIA-MRM将前面用过的样品溶液稀释约10倍在第五步中建立的LC-MRM方法中，修改以下液相参数，另存为FIA-MRM方法采样时间1min50%有机相/水等度洗脱用两通替换色谱柱在Tune项下，双击CompoundOptimization，选择FIA分析根据向导进行自动优化当对源参数含义及设置比较清楚后，可以省略此步完成自动优化后，系统自动生成一个新的采样方法。建新方法中的参数替代旧方法即可39©2012ABSCIEX基础应用培训1.选择合适的初始方法，自动进样器参数2.设定正确的标准样品位置3.设定有优化的离子源参数，中间以“；”隔开12340©2012ABSCIEX基础应用培训驻留时间（DwellTime）驻留时间和色谱峰宽的关系CycleTime(sec)=𝑛[𝐷𝑤𝑒𝑙𝑙(𝑚𝑠ec)+𝑃𝑎𝑢𝑠𝑒(𝑚𝑠ec)]1000n：列表中MRM数目Dwell：每个MRM的驻留时间，上式中默认各MRM驻留时间一致Pause：每两个MRM之间的暂停时间，一般为5(msec)如右上图