灭菌技术

1灭菌1.1灭菌灭菌是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。1.2微生物抵抗力微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种及环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。将培养基、发酵设备或其他目标物中所有微生物的营养细胞及其芽胞（或孢子）杀灭或去除，从而达到无菌的过程。2传统灭菌方法灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌，空气则采用过滤除菌。灭菌，可称为除去或杀灭物质中全部微生物。就一般灭菌方法来说，应根据微生物的种类、污染状况、被污染物品的性质与状态，对下述灭菌方法可单独或合并使用。是否达到灭菌的目地，通常情况下要采用无菌试验法进行判定。对灭菌操作时的温度、压力等是否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。2.1热灭菌法利用高温杀死微生物的方法称为高温灭菌（或热灭菌法）。当高温作用于微生物细胞时，首先引起微生物细胞内原生质胶体的变性，酶结构的破坏，从而使细胞失去了生活机能上的协调，停止生长发育，随着高温的继续作用，细胞内原生质便发生凝固，酶结构完全破坏，活性消失，生化反应停止，渗透交换等新陈代谢活动消失，细胞立即死亡，这就是高温灭菌的基本原理。高温灭菌经济有效，简便易行，是最普遍使用的方法。通常有干热、湿热和间歇加热灭菌等法。2.1.1干热灭菌直接利用火焰将微生物烧死（如烧接种环、载玻片和试管口等）。不能用火焰灭菌的物品则利用热空气灭菌,将物品放在烘箱中加热到160～170℃,持续90分钟，此法适用于玻璃、金属和木质的器皿。2.1.2湿热灭菌高压蒸汽灭菌法是利用高温高压的蒸汽进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌可以杀死一切微生物，包括细菌的芽抱、真菌的抱子或休眠体等耐高温的个体。灭菌的蒸汽温度随蒸汽压力增加而升高，增加蒸汽压力，灭菌的时间可以大大缩短。它属于湿热灭菌，由于湿热灭菌的穿透力比干热灭菌大，杀伤力强，蛋白质、原生质胶体在湿热条件下容易变性凝固，酶系统容易被破坏，蒸汽进人细胞内凝结成水，能放出热量而提高温度，更增强了杀菌力。因此它是一种最有效的、使用最广泛的灭菌方法。以沸水、蒸气和蒸气加压灭菌。巴氏灭菌法就是湿热灭菌，此法有两种方式，①低温长时间处理：在61.7～62.8℃下处理30分钟；②高温短时间处理：在71.6℃或略高温度下处理15分钟。在上述诸法中，以蒸气加压灭菌效果最好，可用常压蒸气灭菌，也可在高压蒸气锅中（一般使用1kg/cm2）灭菌,其蒸气温度可达121℃,能将耐热的芽孢在30分钟内全部杀死。但对某些易被高压破坏的物质，如某些糖或有机含氮化合物，宜在0.61kg/cm2压力下(110℃)灭菌15～30分钟。2.1.3间歇灭菌间歇灭菌连续3天,每天进行一次蒸气灭菌的方法。此法适用于不能耐100℃以上温度的物质和一些糖类或蛋白质类物质。一般是在正常大气压下用蒸气灭菌1小时。灭菌温度不超过100℃,不致造成糖类等物质的破坏，而可将间歇培养期间萌发的孢子杀死，从而达到彻底灭菌的目的。2.1.4渗透压灭菌渗透压灭菌利用高渗透压溶液进行灭菌的方法。在高浓度的食盐或糖溶液中细胞因脱水而发生质壁分离，不能进行正常的新陈代谢，结果导致微生物的死亡。2.2过滤灭菌法过滤灭菌法,即用筛除或滤材吸附等物理方式除去微生物,是一种常用的灭菌方法。对不耐热液体,过滤是唯一实用的灭菌方法.滤器可分为深层型和过筛型两大类。深层滤器主要靠滤材的深度,通过机械性捕获或随机吸附进行过滤,多数滤材属此类型。过筛型滤器以物理过筛法将液体或气体中。有些需要灭菌的材料不能受热，例如许多维生素溶液。因此，许多液体可以用过滤法来灭菌。过滤法不是将微生物杀死，而是把它们排除出去。目前过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，例如用烧结玻璃、不上釉的陶瓷颗粒或石棉压成的滤板等：另一类是滤膜。深层滤器已经使用了100年以上，现在有逐渐被滤膜取代的趋势，但因为大量沉淀物容易堵塞滤膜，所以一般先用深层滤器除去大的颗粒。滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。全办法主要用于气体、水、含有可溶性、不稳定物质的培养基、试验液体和液状医药品等。通常使用的过滤装置有膜过滤器，磁制过虑器、玻璃纤维过虑器等。2.3照射灭菌法2.3.1放射线灭菌法包括放射性同位素在内的，利用从放射源产生γ射线进行照射，是杀灭微生物的一种方法。放射线灭菌在一定条件下利用射线进行灭菌的方法。其他还有电离辐射（射线加快中子等）。目前常用的电离射线主要为γ射线和电子束。近几年，美国军事放射生物研究所（ArmedForcesRadiobiologyResearchInstitute，AFRRI）提出了采用中子辐射对危险细菌和病毒进行灭菌处理，以期得到新的能用于辐射灭菌的资源[1]。波长在25000～80000nm之间的激光也有强烈的杀菌能力,以波长26500nm最有效。辐射灭菌法仅限于某一定材料，因所需设备复杂，难于广泛使用。2.3.2紫外线灭菌法紫外辐射使被照射分子或原子中内层电子提高能级，对微生物细胞有明显的致死作用，是强杀菌剂以波长为265～266nm的紫外线杀菌力最强。紫外线的杀菌机制主要是1、细胞中很多物质都可以吸收紫外线，如细胞原生质中的核酸对紫外线的吸收峰为260nm，蛋白质吸收峰为280nm。紫外辐射作用于核酸时能引起核酸的分子结构的变化最明显的是使DNA形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制，轻则发生突变，重则造成死亡；2、紫外线还可作用于空气中的分子氧变为臭氧，臭氧不稳定，分解放出的新生态氧，有强烈的杀菌作用。由于紫外线的穿透力差,不能透过普通玻璃和其他固体物质,所以紫外线只能用于表面灭菌,不能用于固体物质灭菌。霉菌孢子对紫外线的抵抗力大,紫外线不易穿透,故不能杀死霉菌孢子。通常，灭菌过程采用200～300nm的紫外线。2.3.3高频灭菌法，是直接用照射高频发热杀灭微生物的一种方法。本方法主要用于水、培养基、试验液体和液状的医药品等耐受高频照射的物品。通常采用915或2450兆周的频率。2.4化学灭菌法化学灭菌法主要以药液灭菌法为主，是用药液杀灭微生物的方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等物品的灭菌，还可用于手指、无菌箱或无菌设备等的消毒，药液灭菌用于未变质的物品。通常使用的有乙醇0.1～1w/v%盐化苯类溶液、甲酚、苯酚水或福尔马林水等。3新兴灭菌技术3.1超声波灭菌技术的研究进展传统灭菌通常采用高温加热、化学试剂、紫外线等方法。但是，由于高温加热会破坏物体中的热敏感成份；化学试剂杀菌易引起有害物质残留：紫外线杀菌又具有作用不彻底、存在死角等缺点[2]。因此，人们一直在探索、研究能避免上述因素限制的更迅速、有效的灭菌方法。超声波是指频率大于20khz的声波，其频率高、波长短，除了具有方向性好、功率大、穿透力强等特点之外，还能引起空化作用和一系列的特殊效应，如机械效应、热效应、化学效应等。一般认为，超声波具有的杀菌效力主要由其产生的空化作用所引起的。超声波处理过程中，当高强度的超声波在液体介质中传播时，产生纵波，从而产生交替压缩和膨胀的区域，这些压力改变的区域易引起空穴现象，并在介质中形成微小气泡核。微小气泡核在绝热收缩及崩溃的瞬间，其内部呈现5000℃以上的高温及50000kpa的压力，从而使液体中某些细菌致死，病毒失活，甚至使体积较小的一些微生物的细胞壁破坏，但是作用的范围有限。3.1.1超声波协同臭氧灭菌有实验研究表明：超声能明显地增强臭氧的灭菌率。在相同处理时间下，采用超声波协同臭氧的杀菌率高于单独臭氧处理的杀菌率，当臭氧使用量相同时，可缩短超声处理时间，从而节省超声能量。二者联合使用，能提高灭菌率的主要原因在于：超声能使臭氧气泡粉碎成微气泡，极大地提高溶解速度，增加了臭氧的浓度，高浓度的臭氧能迅速氧化杀灭细菌[3]。3.1.2超声波协同纳米二氧化钛灭菌纳米二氧化钛在紫外光催化下具有洁净和杀菌作用，被广泛用于清洁陶瓷、玻璃及瓷砖表面等材料。在去除水中有机物和杀灭水中细菌的水处理方面亦受到相应的关注。同样，在超声波的辐射下，纳米二氧化钛也具有灭菌的作用，相关学者对纳米二氧化钛与超声波协同灭菌的效果进行了实验研究，得出纳米二氧化钛催化剂与超声波具有明显的协同杀菌作用，Ph值升高对超声波杀菌效果有轻微影响，其杀菌效果比纳米二氧化钛催化紫外光杀菌效果好。纳米二氧化钛催化超声处理不仅具有良好的杀菌作用，并且对光滑表面有一定的洁净作用，可对污染器材进行超声清洗的同时起到杀菌作用[4]。纳米二氧化钛在紫外光催化下具有洁净和杀菌作用，被广泛用于洁具陶瓷、玻璃及瓷砖表面等材料，在去除水中有机物和杀灭水中细菌的水处理方面亦受到相应的关注[5]。当用高于二氧化钛带隙能(3.2Ev)的紫外光能对二氧化钛溶液进行照射时，二氧化钛表面可产生空穴和电子而促进各种化学反应和生物学效应。同理，超声波对二氧化钛也可产生类似的作用。二氧化钛属于半导体光催化抗菌剂，当用高于其带隙能的紫外光能照射时，则可产生相应的电子一空穴对，从而可引发一系列反应。当二氧化钛催化剂在水中受到紫外线照射时，能够自行分解出自由移动的带负电荷的电子和带正电荷的空穴。水溶液中光波或声波可以使二氧化钛发挥催化剂的作用，另外超声波在水中可以使水分子产生杀菌作用的OH自由基，这些因素都是杀菌作用机理所在3.1.3超声波协同激光灭菌激光是一种高能光子流，具有极好的单色性，不论哪种细菌碰上波长265mm附近的激光，杀菌效果最为理想。但激光杀菌最大的弱点就是它的方向性极强，光束细，辐射面积小，从而使得某些细菌能避开袭击。采用超声协同激光灭菌，灭菌效果明显提高。用于杀菌的超声波均采用纵波，而激光是一种电磁波，波动过程表现为横波，声光合用，则会产生一些新的声光特性：原来方向性极强的激光穿过超声场时，受到声波的干扰，强化了激光的反射、折射和散射，尤其是超声空化更加剧了上述作用，并引起了激光的强烈发散，大大扩大了激光的作用范围，使整个生化反应器内部充满了声、光效应。同时，激光作用加速和加剧了空化气泡的破灭和爆炸程度，形成两种能量的迭加，产生更高的能量，从而大大提高杀菌率[6]。3.1.4超声波协同紫外线灭菌紫外线具有较高的杀菌效率，且不会对周围的环境产生二次污染，但其穿透能力较弱，若将其与超声协同作用，灭菌效果将会更好。3.1.5超声波协同微波灭菌微波是指频率在300mhz至300kmhz的电磁波，微波杀菌是微波热效应和非热效应共同作用的结果。微波的热效应主要起快速升温杀菌作用；而非热效应则使微生物体内蛋白质和生理活性物质发生变异，而丧失活力或死亡。3.1.6超声波协同热处理灭菌研究结果表明，相同温度下，经超声波和热处理协同作用(即热超声波)的灭菌效果比单独使用热处理灭菌的效果更好[7]。3.2高压电脉冲灭菌的研究进展脉冲电场技术在生物学领域有不同的应用，除了本文所涉及到得脉冲电场灭菌外，主要还有脉冲电场应用于细胞的电穿孔和电融合。细胞电穿孔(Electroporation)是指在脉冲电场作用下，导致细胞膜或组织膜半透性丧失，膜上出现穿孔的生物物理现象。其电场强度一般在105～106V/M之间。Weaver，Song和Zimmermann等学者对电脉冲导致电穿孔的机理和应用做了详细的分析[8]。细胞融合是指通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将细胞通过无