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激光角膜共焦显微镜角膜的基本解剖结构•上皮细胞层•前弹力层•基质层•后弹力层•内皮细胞层激光共焦显微镜的原理•光源为波长670nm的二极管激光源•激光束聚焦在角膜焦平面，通过振荡镜周期性的移动,连续扫描获得角膜各层二维图像。•光敏探测器可以测到每一点的光反射强度,接收焦平面上的反射光及其周围的散射光。•共焦平面可以通过焦平面调解环进行手动调解,因此可获得角膜各个层面的图像,一系列不同共焦平面的图像组成了三维图像。激光发生器影像探测器针孔样结构分光镜聚光镜焦平面CourtesyofJ.FlanaganPhD,MCOpt670nm共焦激光技术技术参数•光学原理：激光共焦纤维扫描技术•激光光源：670nm•水平分辨率：1um•纵向分辨率：1um•观测范围：400um*400um•放大倍率：800x•扫描深度：1500um•在角膜病诊断中应用的特点-活体组织切片-定性与定量分析-无创伤性-动态观察0µm10µm30µm40µm62µm100µm300µm572µm检查窗口HRTII角膜激光共焦显微镜上皮细胞-30µm基质-300µm内皮细胞–570µm四种检查模式50µmSection模式：可获取角膜不同深度的地形图10µmTiefe:30µm40µm62µm100µm300µm572µm0µmSequence模式：同一焦平面动态扫描同一焦平面动态连续记录图像10幅/秒Volumn模式：序列扫描图像沿Z轴向后连续动态扫描，每幅图像间隔2um，共连续向后扫描40幅图像，深度80µm独有的纵向断层扫描角膜内皮细胞计数功能临床应用药物毒性眼表病变•42岁男性•左眼“霰粒肿”手术后长期频点各种抗生素滴眼液3月余•左眼红痛、流泪2月治疗1月余棘阿米巴性角膜炎感染源：棘阿米巴原虫病理：•病变早期累及上皮，成假树枝状上皮混浊。•病灶反复破溃和愈合，渐向基质深层发展，有大小不等斑片状或盘状基质混浊。•晚期可发生溃疡穿孔。诊断：角膜刮片后培养找到阿米巴原虫；共焦显微镜阿米巴包囊06-08-3006-08-30病例1患者女，19岁，学生.过夜配戴OK镜后出现左眼红、疼痛、视力下降1月deth22μm棘阿米巴性角膜炎包囊病例2患者女,22岁，学生.配戴隐形眼镜后右眼红，畏光，视力下降1月06-11-1006-11-10deth44μm滋养体06-09-1806-09-18deth117μm病例3患者女，19岁，学生.过夜配戴OK镜后左眼红、疼痛、视力下降1月滋养体病变角膜组织切片内可见棘阿米巴包囊(箭头)，PAS染色×40角膜基质层出现断裂，表示扫描区位于溃疡灶内，溃疡边缘可见有细小圆形阿米巴包囊结构，包囊中心可见白色高反光区。阿米巴性角膜炎的微囊离体组织学检查(光学显微镜)活体检查(HRT3)单纯疱疹病毒性角膜炎树枝状角膜炎•可为单发或多发，组织学上的上皮损害表现为沿树枝状走行曲的细胞丧失。•单个损害可扩大，或邻近的损害融合成大的病灶，形态不规则，呈“地图状”损害，组织学上“地图状”损害可累及基底层上皮细胞。•反复感染可累及角膜深层。•角膜上皮下感觉神经丛及上皮内神经末梢受损，从而出现角膜知觉减退。盘状角膜炎•可在上皮感染的同时或之后发生，为一种亚急性或慢性坏死性炎症。•轻型病例角膜混浊可完全吸收，长期或复发性病例，基质炎症由前弹力层扩展至深层基质。•病变早期表现为板层水肿，细胞内和细胞间有液体积聚•随着炎症发展，板层可发生断裂，白细胞从角膜缘倾入病灶，•晚期板层破坏严重，见大量巨噬细胞，血管侵入坏死灶，出现炎性肉芽肿性病变。•最终出现不规则胶原沉积。共焦显微镜下见，前弹力层局部出现皱褶，上皮下角膜神经穿过皱褶处见皱褶甚至断裂。患者，XXX，女，既往患双眼病毒性角膜炎史三年，三年来双眼反复发作，来我院行共焦显微镜检查示，双眼角膜上皮下神经广泛断裂，局部扭曲。真菌性角膜炎病因：致病真菌直接侵入角膜感染所致。多见于农业性外伤（植物擦伤）或剔除泥土、砂石等角膜异物后。感染源：常见为曲霉菌、镰刀菌、白色念珠菌、头孢霉菌、酵母菌。病理：•早期角膜基质有脓疡形成，周围基质有卫星状浸润坏死灶，内有破碎的板层和中性粒细胞浸润，坏死灶内很少见完整的霉菌，但周围基质内却有大量菌丝。•随着病情进展，临近脓疡趋于愈合，坏死物质连同表面组织脱落形成溃疡，坏死程度依霉菌毒力、抗原性、菌株种类而异。•部分霉菌可穿过后弹力层，形成角膜穿孔。•适当的抗霉菌治疗可使溃疡愈合而留有白斑，若发生穿孔，常形成粘连性角膜白斑。诊断：•临床表现•坏死组织真菌培养•坏死组织涂片检查：找到真菌菌丝•角膜共焦显微镜检查：活体直接找到菌丝。角膜浅基质层基质紊乱，可见大量菌丝分布，基质层结构破坏，散在分布炎性细胞。予全身及局部抗真菌治疗一周后复查共焦显微镜，可见菌丝有明显减少。患者，XXX，因“左眼眼痛、畏光、视物不见两月”，外院诊断“真菌性角膜炎”，予抗真菌治疗后症状好转，但视力无明显提高。入院行角膜共焦显微镜检查可见基质有高反光区域，仅少量短小菌丝结构，但可见大量树突状细胞散在分布于基质层内。真菌性角膜炎颗粒状角膜营养不良组织病理学变化：角膜上皮变薄，前弹力层破坏，实质浅层细胞内外有淡嗜伊红染色颗粒状物，从实质层经过前弹力层破损处进入上皮层内。上皮和前弹力层尚完整，基底细胞失去极化，上皮下有颗粒物质沉着，前弹力层消失。实质层内亦有颗粒或面包屑样物质沉着，且部分融合成团块状。角膜上皮细胞呈局限性蜂窝状改变，细胞反光增强，上皮层和基质层可见大量强反光区域，病变局限，与正常组织分界清晰。Fuch角膜内皮营养不良病例•患者女47岁•主诉双眼视物模糊3年否认家族史•查体视力OD0.3OS0.3双角膜轻度水肿，后弹力层可见角膜小滴，中央角膜较多•诊断Fuch内皮营养不良OS基质层后弹力层角膜小滴OD内皮细胞内皮层可见多量角膜小滴,其间有增大的内皮细胞增厚的后弹力层内皮层Fuchs营养不良角膜小滴corneaguttataN=272mm-2KeratocytesEndotheliumN=682mm-2BasalcellsWingcellsSuperficialcells角膜移植N=810mm-2N=11102mm-2N=6540mm-2N=5003mm-250µmBowmanmembran02.08.2000Pat.:w.,57J.LASIK术后•患者女２７岁•双眼LASIK术后•检查：角膜瓣下大小不等．颗粒样混浊LASIK术后角膜瓣下混浊ODOS06-10-1006-10-10基质层基质层基质层内大小不等高密度颗粒异常神经结构LASIK术后6个月的基质.post-op•深度:150µm,LASIK切割带•碎片,新神经,活性角膜细胞50µm50µm50µm患者，XX，因“双眼刺痛、畏光一年余”就诊，裂隙灯检查示角膜缘可见沟状溃疡，深达角膜厚度的1/2。共焦显微镜检查角膜缘溃疡结构，见角膜缘基质结构紊乱，有新生血管长入，周围分布大量树突状细胞。边缘性角膜溃疡患者，XX，男，14岁，因“双眼红、痒一周”于2007年4月就诊，为过敏体质，裂隙灯见结膜充血水肿，角膜缘毛细血管网充盈，睑结膜面呈铺路石状改变，诊断为“双眼春季卡他性结膜炎”。春季卡他性结膜炎共焦显微镜检查，发现角膜表层及上皮层可见大量树突状细胞，以角膜缘最集中。角膜缘结构紊乱，局部可见高反光混浊区。共焦激光角膜显微镜优势•角膜活体组织学检查，精确显示角膜各层结构•分辨率高至1µm，800x放大倍率•多种图像获取模式–单一图像–z-轴向后40幅动态图像连续扫描，每幅图像间隔1.5µm–同一焦平面动态连续记录图像10幅/秒•角膜厚度测量•独有活体角膜断层观察•自动图像分析和细胞计数•水肿情况依然可以观察角膜应用临床诊疗•各种感染性角膜病的诊断•角膜变性性疾病的诊断•泪膜异常性疾病的诊断•免疫相关性角膜疾病的诊断•各类角膜手术术后随访•各种角膜疾病治疗随访基础研究活体细胞水平研究角膜生理病理变化及影响因素各种眼表泪液性疾病的发病机制活体细胞水平研究各类角膜手术创口愈合机制及影响因素免疫相关性及其他各类角膜疾病的机制研究角膜内皮细胞检查正常人的角膜内皮细胞•为一单层扁平细胞，呈六边形镶嵌结构，大小均匀、排列整齐。•角膜内皮细胞密度随年龄增高而逐渐下降，1~10岁时最高，20~50岁时相对稳定，60岁以后明显下降。正常人30岁前，平均角膜内皮细胞密度为3000～4000个／mm2•维持正常角膜内皮屏障功能所需最低临界密度700个／mm2角膜内皮镜检查•利用镜面反射原理，由于角膜内皮细胞和房水屈光指数不同，二者之间形成了界面，当一窄光术聚焦在这一界面上时引起反射，内皮细胞各部分反射程度的差异显示出细胞的边界。主要是观察角膜中央部分的内皮细胞，一般是分析计算内皮细胞的形态、大小、密度及计算机分析，可以深入地了解内皮细胞的形态改变情况临床应用（1）对长期配戴角膜接触镜的人可以了解其角膜内皮状况。（2）可用于评价角膜材料保存情况。（3）在内眼手术前用角膜内皮镜可评价手术的可行性。观察指标1、内皮细胞形态：六边形，大小相等，均匀规则，边界清晰2、内皮细胞边界：正常呈清晰的暗的直线，有时可见几个细胞出现双边，这可能是光学上的阴影现象3、暗结构和角膜后表面形态：暗区表示该处的内皮细胞已不出现。较大的暗区多发生于角膜内皮病变4、角膜内皮后表面：正常时呈直线型，异常时呈波浪或锯齿型。normal离体新鲜猪眼超乳术后1h，内皮水肿变形，局部内皮缺损，呈黑区改变。Fuch’s角膜营养不良后弹力层见不规则高反光混浊区，内皮表面可见散在小凹，内皮细胞水肿，边界不规则，细胞核可见。局部可出现细胞凋亡，呈“黑洞”结构。XX，女，患有“马凡综合征”，来我院行晶体摘除手术。术前查共焦显微镜显示角膜内皮细胞广泛水肿，细胞核增大、反光增强，部分区域无明显内皮细胞结构。