X射线晶体衍射分析

X射线晶体衍射分析X射线晶体衍射分析(X-rayCrystallography,X-rayDiffractionMethods)梁毅梁毅(武汉大学生命科学学院)(武汉大学生命科学学院)测定生物大分子三维结构的主要方法测定生物大分子三维结构的主要方法完整、精确、实时(动态)地测定生物大分子三维结完整、精确、实时(动态)地测定生物大分子三维结构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂以及它们之间的复合物。直接测定生物大分子三维结构的主要实验方法有直接测定生物大分子三维结构的主要实验方法有:X射线晶体衍射分析(亦称X射线结晶学或晶体结构X射线晶体衍射分析(亦称X射线结晶学或晶体结构分析)、核磁共振波谱分析(NMR)、电镜三维重构、分析)、核磁共振波谱分析(NMR)、电镜三维重构、扫描隧道显微技术(STM)和原子力显微技术(AFM)。AtomicStructureDeterminationbyAtomicStructureDeterminationbyXrayCrystallographyX-rayCrystallographyd/and/orNlMiRNuclearMagneticResonanceElectronMicroscopyElectronMicroscopypypyX射线晶体衍射分析X射线晶体衍射分析迄今仍然是蛋白质和核酸三维结构测定的主要方法。美国蛋白质数据库(PDB)存入的三维结构数据美国蛋白质数据库(PDB)存入的三维结构数据,截止目前,已经存入国际蛋白质三维结构数据库截止目前,已经存入国际蛋白质三维结构数据库的蛋白质、核酸和糖类的三维结构已超过145000套(其中晶体结构超过130000套，NMR结构套，冷冻电镜结构近套。结构12300套，冷冻电镜结构近2500套)。ProteinDataBank:ProteinDataBank:伦琴（Röntgen）发现X射线（1895年）g及其后劳埃（Laue）发现晶体的X射线衍射（1912年），从而开创了晶态物质结构研究的新纪元。研究的新纪元。1953年Pert在当时的同晶置换原理上，1953年Perutz在当时的同晶置换原理上，发现了重原子同晶置换法可以解决生物大发现了重原子同晶置换法可以解决生物大分子晶体结构测定中衍射的相位问题，从而X射线晶体衍射分析开始踏上了自己发展的伟大历程。展的伟大历程。X-raycrystallographyyygpyThefirstpublishedobservationofthecrystallizationofaprotein,hlbifththdbFLHRfldi1840hemoglobinfromearthworm,wasauthoredbyF.L.HRnefeldin1840;Thefirstx-raycrystallographicstructuralresultsonaglobularproteinTheNobelPrizeinChemistry1962TheNobelPrizeinChemistry1962molecule,myoglobin,werereportedbyJohnKendrewin1957.MaxFerdinandPerutzJohnCowderyTheNobelPrizeinChemistry1962fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteinsTheNobelPrizeinChemistry1962fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteinsKendrew1/2oftheprize1/2oftheprizeUnitedKingdomUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomgb.1914(inVienna,Austria)d.2002b.1917d.1997在1957年和1959年Kendrew和Perutz分别获得了肌红蛋白和血红蛋白的低分辨率（6Å和5Å）结构，在此期间Watson和Crick共同建立了DNA双螺旋的在此期间Watson和Crick共同建立了DNA双螺旋的结构模型。他们的伟大成就为分子生物学奠定了基础。础。上述4位科学家分别获得1962年度Nobel化学奖和生上述位科学家分别获得年度化学奖和生理或医学奖。从1957年到1967年的十年里，在溶菌酶结构之后，从1957年到1967年的十年里，在溶菌酶结构之后，胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶等也分别获得了高分辨率的晶体结构，表明X射线晶体衍射分析已经成为一门成熟的学科。射线晶体衍射分析已经成为一门成熟的学科。从六十年代末进入七十年代，X射线晶体衍从六十年代末进入七十年代，X射线晶体衍射分析从对生物大分子三维结构测定迈入生物大分子三维结构及其生物学功能之间关系的研究，从而它既是分子生物学研究的有力的重要手段，同时也开始为结构生的有力的重要手段，同时也开始为结构生物学的建立和发展创造着条件。物学的建立和发展创造着条件。今天的X射线晶体衍射分析已经完全超越单今天的射线晶体衍射分析已经完全超越单纯晶体结构测定的本身，而是直接瞄准待测结构的生物大分子的功能，瞄准那些与功能紧密联系在一起的生物大分子复合物的晶体紧密联系在一起的生物大分子复合物的晶体结构，如酶与底物(DNA聚合酶—DNA)、酶结构，如酶与底物(DNA聚合酶DNA)、酶与抑制剂(溶菌酶-(NAG)3)、激素与受体(人生长激素与其受体)、抗原与抗体(流感病毒神经氨酶单克隆抗体)、与其结合蛋白神经氨酶-单克隆抗体)、DNA与其结合蛋白(TATAbox与其结合蛋白)等。(TATAbox与其结合蛋白)等。现在，X射线晶体衍射分析已被应用到测定由现在，X射线晶体衍射分析已被应用到测定由许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装许多生物大分子组成的极其复杂的大分子组装体(Macromolecularassembly)的晶体结构，如组成细胞骨架的微管系统(Microtubules)、由200多种不同的蛋白质组成的细菌鞭毛(flagella)200多种不同的蛋白质组成的细菌鞭毛(flagella)和由60个不同的蛋白质分子和3条RNA链组成的分子量高达230万的核糖体等。其中核糖体大亚基的分析已达29埃分辨率，是当前X射线大亚基的分析已达2.9埃分辨率，是当前X射线晶体结构分析的一个突破。晶体结构分析的一个突破。现在，X射线晶体衍射分析已不再满足于静态晶体现在，X射线晶体衍射分析已不再满足于静态晶体结构的测定，而追求与生物大分子发挥生物功能相伴随的动态晶体结构的测定。生物大分子及其相伴随的动态晶体结构的测定。生物大分子及其复合体的结构不是刚性的，而是有柔性的，存在复合体的结构不是刚性的，而是有柔性的，存在着在不同层次的不同自由度的运动，它们是生物大分子发挥生物功能的基础和条件。另一方面，生物大分子发挥功能的过程就是和其他分子相互生物大分子发挥功能的过程就是和其他分子相互作用的过程，也是构象变化的过程．因此生命的结构必然是运动的结构，晶体结构分析也必须分析晶体结构的运动。析晶体结构的运动。射线晶体结构分析正努力在第四维时间X射线晶体结构分析正努力在第四维时间坐标上跟踪、分辨和描述生物大分子的坐标上跟踪、分辨和描述生物大分子的结构变化，即所谓四维晶体结构测定。结构变化，即所谓四维晶体结构测定。由于同步辐射所提供的X射线光源可以达到很高强度，因而可以在以秒计的时间范围收集一套完整的衍射数据，使得在范围收集一套完整的衍射数据，使得在以秒计的时间范围内的结构动态测定成以秒计的时间范围内的结构动态测定成为可能。那么，生物大分子在晶体状态下的结那么，生物大分子在晶体状态下的结构是否反映了在有机体内的真实结构?构是否反映了在有机体内的真实结构?回答是肯定的。实验结果表明，大部回答是肯定的。实验结果表明，大部分生物大分子的晶体结构(tl分生物大分子的晶体结构(crystalstructure)接近于其用核磁共振波谱structure)接近于其用核磁共振波谱法测得的溶液结构(solution法测得的溶液结构(solutionstructure)。structure)。综上所述，射线晶体衍射分析可在原子或接近原综上所述，X射线晶体衍射分析可在原子或接近原子的水平上分析蛋白质的精细三维结构，并适用于子的水平上分析蛋白质的精细三维结构，并适用于研究各种大小蛋白质的结构，甚至可以测定全病毒和核糖体的结构。晶体结构提供的是静态（在一定程度上也表现出动态），但是极为精确的一个个蛋程度上也表现出动态），但是极为精确的一个个蛋白质分子堆积于晶体中的画面。白质分子堆积于晶体中的画面。X射线晶体衍射曾经是蛋白质结构测定的唯一手段，并且在现在和可见的将来仍将是原子水平上解析蛋白质结构的最主要和最有效的手段。白质结构的最主要和最有效的手段。TheX-raystructureisnotatrueimageDiffractionPatternSingleCrystalTheX-raysarescatteredfromaregularrepeatingarrayofmolecules(asinglecrystal)togiveapattern,StructuralModel(gy)gp,diffractionpatternthatrepresentsthemacromolecularorderandstructure.X-rayshavetheproperwavelengthtobescatteredbytheelectroncloudofanatom.yppgyExperimentalSetupExperimentalSetupCCDcameras最近一些年，X射线晶体衍射分析无论从结最近一些年，X射线晶体衍射分析无论从结构测定的方法还是从结构测定所用的仪器上构测定的方法还是从结构测定所用的仪器上都有了飞跃的发展。可变波长的同步辐射加速器的应用使高分辨率、高质量的衍射数据变得较为容易获得。低温技术的广泛应用使冷冻后的蛋白质晶体低温技术的广泛应用使冷冻后的蛋白质晶体在衍射过程中所受的辐射损害大为减小，从在衍射过程中所受的辐射损害大为减小，从而降低了对晶体的要求并提高了数据质量。而降低了对晶体的要求并提高了数据质量。各种形式的面探测器和CCD的出现大幅度提高了各种形式的面探测器和CCD的出现大幅度提高了数据收集速度及精度。而各种计算机硬件和软件的发展更为晶体学发展提供了强有力的计算工具。如今，在相当程度上，X射线晶体衍射分析已成为如今，在相当程度上，X射线晶体衍射分析已成为一种常规的技术手段，它可在原子或接近原子的水一种常规的技术手段，它可在原子或接近原子的水平上分析蛋白质的精细三维结构。3Å以上分辨率的蛋白质精细结构可提供丰富的信息如特定原子的位置它们之间的相互关系（如息,如特定原子的位置,它们之间的相互关系（如氢键等）,溶剂的亲和性及分子内柔性的变化等。氢键等）,溶剂的亲和性及分子内柔性的变化等。