免疫检测技术

第九章免疫检测技术免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法。具有高度精确、灵敏、特异的特点。可用于免疫学的基础理论和应用研究，也可应用于生物学研究的各个领域。1、免疫疾病诊断2、动物植物生理活动研究（激素、维生素）3、物种及微生物鉴定4、动物、植物性状的免疫标记5、免疫增强药物和疫苗的研究6、发病机理研究7、分子生物学研究免疫检测技术在生物科学领域中的应用：第一节抗原抗体反应原理抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可用已知抗原检测标本中有无相应抗体。这种特性就是许多免疫检测方法的基础!!一、体外抗原抗体反应的特点①特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。②可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，但在一定条件下可解离。（低酸、高盐）③比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的反应现象。（网格理论）④阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。网格理论——解释抗原抗体形成沉淀的机制网格学说（latticetheory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗原抗体二、影响抗原抗体反应的因素①温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应速度，缩短反应时间，常用反应温度为37-45℃。②溶液的pH：pH过高或过低可改变抗原和抗体理化性质，影响反应结果，因此溶液的pH应适宜（pH6-8）。③电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85%NaCl）参与，否则不出现可见反应。三、抗原抗体反应类型1.沉淀反应2.凝集反应3.补体参与的反应4.中和反应5.免疫标记技术第二节常见免疫检测方法可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。一、免疫沉淀反应一、免疫沉淀反应1.液相沉淀反应2.凝胶扩散沉淀3.凝胶免疫电泳絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验血清免疫电泳火箭电泳对流免疫电泳免疫印迹等絮状沉淀试验操作步骤：（1）将可溶性抗原作一系列倍比稀释。（2）各管加入一定浓度的适量抗血清。（3）振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。（4）产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。环状沉淀试验操作步骤：（1）用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免产生气泡。（已知！）（2）将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待测！）（3）置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。（诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。2.凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。最常用的方法为：①单向琼脂扩散试验②双向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验原理：将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质，使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。单向免疫扩散试验示意图双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。3.免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等血清免疫电泳将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。免疫电泳原理图解火箭免疫电泳火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。沉淀线的高度与抗原量成正比火箭电泳图二、凝集反应（Agglutination）颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。妊娠免疫诊断试验孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗体。三、补体结合实验（2个系统，5种成分）•已知抗原加入血清（检测抗体）–加入标准量补体–加入包被抗体的红细胞–检测红细胞溶解情况AgPatient’sserumAbNoAbAg三、补体结合实验（2个系统，5种成分）免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。四、免疫标记技术常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术四、免疫标记技术该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技术（125I）放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性放射免疫测定法(RIA)示意图RIA法原理及标准曲线7550301001101001000未标记抗原浓度（ng/mL)结合/未结合的放射活性（%）Ag*-AbAg*将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。2.免疫荧光技术免疫荧光技术——直接法Ag荧光素标记的特异性抗体组织切片免疫荧光技术——间接法Ag荧光素标记的抗抗体组织切片待测抗体免疫荧光染色显示细胞骨架免疫荧光染色是利用抗原－抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种显示绿色荧光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488显示红色荧光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa－350用Alexa488标记的抗人α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片)PtK1细胞免疫荧光染色本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分析、判断结果。常用方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组织中或细胞表面的抗原。3.免疫酶测定法是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行的抗原抗体反应。实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物为二苯基联苯胺。酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA试验三个必要的试剂(1)固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）(2)酶标记的抗原或抗体（标记物）(3)酶作用的底物（显色剂）底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234基本步骤五种常见的检测方法1双抗夹心法（测定抗原）2测定抗体的间接法3竞争法（测定抗原）4捕获包被法测IgM抗体5ABS-ELISA法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心1双抗夹心法测抗原2间接法测抗体几种标记/检测技术灵敏度的比较酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9几种标记/检测试剂的有效期比较酶标荧光放免发光有效期（月）1815129630020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒仪器特殊防护治理污染人民币人民币三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用放免酶标发光A.将Ab吸附在固相载体表面;B.加入酶标Ag和待测Ag，竞争结合Ab；对照只加入酶标Ag；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知Ag量。3竞争法测定抗原血清标本中的IgM包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合抗人IgM抗体包被加入血清标本加入特异性抗原试剂加入针对特异性抗原的酶标抗体加底物显色4捕获包被法测IgM抗体捕获法原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，生物素为小分子化合物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。1个亲和素分子可与4个生物素分子结合。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可提高ELISA的敏感度。5ABS-ELISA法ABS-ELISA法①：固相支持物；②：样品；③：特异性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；⑥：DAB显色液；⑦：显色；