蛋白质分子量的测定

第四章蛋白质的共价结构主要内容•1、蛋白质通论•2、肽•3、蛋白质一级结构的测定•4、蛋白质的氨基酸序列与生物功能第四章蛋白质的共价结构（一）蛋白质的化学组成蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50％氢7％氧23％氮16%硫0—3％其他微量4.1蛋白质通论蛋白质的含氮量蛋白质中氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数6.254.1蛋白质通论蛋白质的分类•组成上分：单纯蛋白质、缀合蛋白质。•功能上分：酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白等9类。•形状上分：纤维蛋白、球蛋白、膜蛋白。4.1蛋白质通论（二）蛋白质的大小蛋白质是相对分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。4.1蛋白质通论•蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。一般规定最小的蛋白质是胰岛素，相对分子量为5.7K。•某些蛋白质是由两个或更多个多肽链通过非共价键结合而成的，称寡聚蛋白质。每条多肽链称为亚基或亚单位。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。4.1蛋白质通论（三）蛋白质结构层次4.1蛋白质通论二、肽PEPTIDE4.2肽1、肽与肽键结构蛋白质中氨基酸之间的基本连接为肽键（peptidebond）,除此之外还有二硫键（disulfidebond）。肽键的形成4.2肽1、肽与肽键结构某五肽命名：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu4.2肽1、肽与肽键结构肽平面（酰胺平面）：由六个原子组成（2Cα、C、H、O、N）C-N具有部分双键性质4.2肽1、肽与肽键结构C-N具有部分双键性质4.2肽2、肽的理化性质□肽晶体的熔点均较高；□肽的酸碱性质主要处决于游离末端α-NH2和α-COOH及侧链R基的可解离功能基团；在长肽上主要是侧链上的；□小肽的滴定曲线与氨基酸相似；□肽的化学反应与氨基酸相似；□双缩脲反应是二个或二个以上肽键化合物所特有的反应；□小肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和；4.2肽双缩脲反应:当脲（即尿素）加热到180℃时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲，然后在碱性溶液中与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。CNH2NH2OCNHHNH2O加热，180℃CNH2NHOCNH2ONH3CU2+H2OH2ONHNHNNCOCRCOCRCOCRCOCR+Cu2+4.2肽3、天然存在的活性肽COCH2CH2CHNH2COOHNHCHCH2SHCONHCH2COOHgamma-Glu-L-Cys-AlaGSH（谷胱甘肽）GSH可被氧化成GSSGGSH作用：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在；维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。例如，它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化成三价铁形成高铁血红蛋白。4.2肽短杆菌肽（抗生素）L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val对革兰氏阳性菌有强大抑制作用。见P5324.2肽加压素和催产素两者只差两个氨基酸，但生理作用不同4.2肽甜味素Asp-Phe-OCH3，比蔗糖甜200倍。三、蛋白质一级结构的测定1969年，国际纯粹与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。4.3蛋白质一级结构的测定牛胰腺核糖核酸酶A的一级结构4.3蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定•蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。•氨基酸序列测定有直接法和间接法两种：直接法，用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出氨基酸顺序；间接法，通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断氨基酸的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。4.3蛋白质一级结构的测定第一步、前期准备•分离纯化蛋白质（纯度97%以上）•蛋白质分子量的测定（电泳法、凝胶过滤法、超离心法等）4.3蛋白质一级结构的测定第二步、多肽链的数目测定与拆分A、测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数目。4.3蛋白质一级结构的测定B.多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。4.3蛋白质一级结构的测定对于借助非共价键连接在一起的几条多肽链，如，四聚体血红蛋白，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).4.3蛋白质一级结构的测定对于几条多肽链通过二硫键交联在一起的。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。也可应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键4.3蛋白质一级结构的测定第三步、蛋白质的氨基酸组成分析•首先用6MHCl将蛋白质样品水解•水解后样品用离子交换色谱分离，然后与茚三酮反应后，被检测器定量检测。•也可通过反相HPLC分离检测。方法是先将样品与Edman试剂（PITC）反应，然后利用氨基酸侧链疏水性的差异进行分离。4.3蛋白质一级结构的测定4.3蛋白质一级结构的测定第四步、分析多肽链的N-末端和C-末端•多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸和C-端氨基酸。•N-端氨基酸和C-端氨基酸分析的目的是建立两个重要的氨基酸序列参考点。4.3蛋白质一级结构的测定N-端氨基酸测定——DNFB法•测定路线：DNFB→DNP-肽→酸水解→乙醚萃取→层析鉴定。•特点：α-DNP氨基酸容易和侧链DNP氨基酸分离。4.3蛋白质一级结构的测定N-端氨基酸测定——丹磺酰氯法•测定路线：DNS-DNS-肽→酸水解→乙醚萃取→层析鉴定。•特点：DNS-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。4.3蛋白质一级结构的测定N-端氨基酸测定——PITC法•测定路线：PITC→PTC-肽→PTH-氨基酸→乙醚萃取→层析鉴定。•特点：只切去N端-氨基酸，其余肽端保持完整。4.3蛋白质一级结构的测定N-端氨基酸测定——氨肽酶法•氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解肽键。•根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。•常用的有亮氨酸氨肽酶（水解N-末端为Leu的肽键速度最快）、焦谷氨酸氨肽酶（水解N-末端为焦谷氨酸，即环化的谷氨酸）。4.3蛋白质一级结构的测定•测定路线：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。游离C-端氨基酸可用DNFB法或DNS法并通过层析技术鉴定。•特点：是目前C-末端残基测定的最重要的化学方法，但Gln、Asn、Cys被破坏，C-末端的Arg变成Orn，不能分析。C-端氨基酸测定——肼解法H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸4.3蛋白质一级结构的测定C-末端鉴定——还原法肽链C-末端AA残基可用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇然后用酸将肽完全水解，用层析法加以鉴定生成的α-氨基醇。Sanger早期用此法鉴定胰岛素A、B链的C-末端氨基酸残基。4.3蛋白质一级结构的测定C-端氨基酸测定——羧肽酶法•羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。•目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。•羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键，羧肽酶Y可作用于任何一个C-末端氨基酸残基。4.3蛋白质一级结构的测定Val-Ser-GlyA、多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。第五步、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化B、常用的断裂方法是：酶裂解法和化学裂解法。4.3蛋白质一级结构的测定1、酶裂解法•常用的蛋白水解酶包括：胰蛋白酶，糜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等。•酶裂解的特点是：蛋白酶只裂解特定的肽键。4.3蛋白质一级结构的测定A、胰蛋白酶（Trypsin）•仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。•产生的肽段数目等于多肽链中Arg和Lys总数加1（多肽链的C末端肽段）4.3蛋白质一级结构的测定B、糜蛋白酶（Chymotypsin）•专一性不如胰蛋白酶，作用于Trp、Tyr、Phe等疏水氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。•如疏水氨基酸为Trp、Tyr、Phe时，水解快，为Leu，Met和His时水解稍慢。4.3蛋白质一级结构的测定C、胃蛋白酶•专一性与糜蛋白酶类似，但要求断裂点两侧的氨基酸都是疏水性氨基酸。•最适pH为2。（糜蛋白酶为8-9）•确定二硫键位置时常用胃蛋白酶水解。4.3蛋白质一级结构的测定2、化学裂解法•化学裂解法获得的肽端一般都比较大，适合在自动序列仪种测定序列，因此，化学法对相对分子量大的蛋白质序列测定是很重要的。•溴化氰断裂是最常用的化学断裂方法。仅作用于Met的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。4.3蛋白质一级结构的测定•羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。4.3蛋白质一级结构的测定第六步、分离肽段，测定氨基酸序列•多肽链用上述方法断裂后，所得的肽段混合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC等方法进行分离纯化。•氨基酸序列测定主要使用Edman化学降解法，此外还有酶降解法、质谱法等。4.3蛋白质一级结构的测定A、Edman化学降解法•Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。氨基酸序列测定仪测序过程示意图B、质谱法•质谱法测序的优点是灵敏度高，所需样品少，测定速度快，蛋白质的水解液经毛细管电泳或HPLC分离后直接进样MS/MS，免去繁重的肽分离纯化工作。质谱测定的基本步骤——电离•a）蛋白质溶液在高电场中通过毛细管静电喷射，形成携带高电荷的微滴；b）蛋白质分子从微滴中被解吸进入气相；c）蛋白质离子进入质谱进行分析。多肽分子量的确定•用计算机分析多肽核质比数据，得出多肽的准确分子量。•选定的多肽在碰撞池中裂解成更小的离子碎片，进入第二台质谱仪进行分析。•裂解主要发生在多肽中连接相继氨基酸的肽键上，因此产生的碎片代表一套大小只差一个氨基酸残基的肽段。质谱测定的基本步骤——二级电离第七步、肽段在多肽链中位置的确定•利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。4.3蛋白质一级结构的测定示例(十六肽的水解)•所得资料：Ｎ端：H，Ｃ端：ＳＡ法裂解：DNSPSEDVERLAHDWTＢ法裂解：SEDWTDNVERLAPSHD•重叠法确定序列:HDWTAPSWTDNRLADNSVERLEDVE4.3蛋白质一级结构的测定