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MALDI样品制备方法样品制备流程待分析物种类/分析目的选择适当的基质配置样品/基质溶液选择适当的样品靶选择适当的点靶方法点靶TheidealsamplepreparationinMALDIwouldbeahomogenouslayerofsmallmatrixcrystalscontainingasolidsolutionoftheanalyte.命名法Targettypes:GroundSteelPolishedSteelAnchorChipStandard(800µm)AnchorChipSmall(400µm)Matrices&HCCAα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(BrukerPart-No.#201344)additives:2,5-DHB2,5-Dihydroxybenzoicacid(BrukerPartno.#201346)sDHB90:10mixtureof2,5-DHBand2-Hydroxy-5-methoxybenzoicacid(BrukerPartno.#209813)2,5-DHAP2,5-Dihydroxyactetophenone(BrukerPartNo.#231829)SATrans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid(BrukerPartNo.#201345)1,5-DAN1,5-Diaminonaphthalene3-HPA3-Hydroxypicolinicacid(BrukerPartNo.#201224)DACDiammoniumhydrogencitrateNH4H2PO4Ammoniumphosphate,monobasicTFATrifluoroaceticacidSolvents:ACNAcetonitrileTA3030:70(v/v)Acetonitrile:TFA0.1%inwaterTA5050:50(v/v)Acetonitrile:TFA0.1%inwaterTA8585:15(v/v)Acetonitrile:TFA0.1%inwaterTA9090:10(v/v)Acetonitrile:TFA0.1%inwaterTA9595:5(v/v)Acetonitrile:TFA0.1%inwaterEtOHEthanolH2OWater一、基质的选择AnalyteMatrix多肽HCCAα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid多肽/多糖/蛋白2,5-DHB2,5-Dihydroxybenzoicacid蛋白2,5-DHAP2,5-DihydroxyactetophenoneSASinapicacid蛋白（TDS）sDHB90:10mixtureof2,5-DHBand2-Hydroxy-5-methoxybenzoicacid1,5-DAN1,5-Diaminonaphthalene核酸3-HPA3-Hydroxypicolinicacid聚合物IAAtrans-Indole-3-acrylicacidDITDithranol二、样品制备法的选择•Drieddropletmethod•基质溶液与样品溶液等体积混合，直接点靶•Thinlayermethod•先点基质形成薄层，再点样品•Doublelayermethod•先点基质，再按照drieddroplet法点样三、靶板的选择Groundsteeltarget常规样品分析。灵敏度一般Polishedsteeltarget常规样品分析。灵敏度一般AnchorChipStandard(800µm)蛋白质组学样品(酶解样品)，灵敏度较好AnchorChipSmall(400µm)适用于寡核苷酸样品分析GroundSteel•适用范围•所有基质的drieddroplet样品制备法•聚合物分析•SA基质doublelayer样品制备法•优点•对污染物的容忍度比较好•缺点•相对不适合于自动化采集•灵敏度较低Polishedsteel•适用范围•与groundsteel一样，应用范围广•最适用于thinlayer样品制备法•优点•有机溶剂扩散快，有利于形成薄层•高分子量聚合物分析（100kDa）•缺点•采用drieddroplet样品制备法，易形成较大的晶体颗粒，质量精度比较差•采用thinlayer样品制备法，采集数据时，需要不停移动采样位置（randomwalk）ProtocolOverviewAnalyteMatrixTargetTypeProtocol多肽HCCAGroundSteelAnchorChipStandard(800µm)AnchorChipStandard(800µm)Pre-spottedAnchorChip(PAC)Pre-spottedAnchorChip(PAC)DrieddropletDrieddropletDrieddroplet/nano-LCcouplingThinlayer/driedsampleThinlayer/affinity多肽/多糖/蛋白2,5-DHBGroundSteelAnchorChipStandard(800µm)DrieddropletDrieddroplet蛋白2,5-DHAPGroundSteelDriedDroplet蛋白SAGroundSteelDoubleLayer蛋白(TDS)sDHBGroundSteelDriedDroplet蛋白(TDS)1,5-DANGroundSteelDriedDroplet核酸3-HPAGroundSteelAnchorChipSmall(400µm)DriedDropletDriedDroplet样品制备方法DithranolDithranol(DIT)很适合非极性聚合物的分析制样方法：A.聚苯乙烯•把聚苯乙烯(10-3M)、DIT(0.1M,22.6g/l)和三氟乙酸银(5g/l)分别溶于THF。•再按体积比10:10:1混匀，取1ul点靶。室温放干。B.N-异丙基丙酰胺•把N-异丙基丙酰胺(10g/l)、DIT(20g/l)和三氟乙酸银(10g/l)分别溶于THF。•再按体积比10:10:1混匀，取1.5ul点靶。室温放干。IAAtrans-Indole-3-acrylicacidIAA主要用于分析可溶于有机溶剂的合成的非极性聚合物，也可用于复杂的多肽和蛋白质混合物。样品制备聚异丁烯酸甲酯(PMMA)•把PMMA聚苯乙烯(10-4M)、IAA(0.1M,18.7g/l)和三氟乙酸银(5g/l)分别溶于THF。•再按体积比10:10:1混匀，取1ul点靶。室温放干。聚合物基质的选择适合于多肽，蛋白酶解产物分析样品靶:Groundsteel基质溶液配制:用TA30配制HCCA饱和溶液样品:用0.1%TFA或者TA30溶解样品制备:1.取1µl样品和1µl基质均匀混合，2.取1µl混合溶液点在样品靶上，自然干燥HCCA,drieddroplet样品靶:AnchorChipStandard(800µm)基质溶液配制:用TA85配制0.7mg/ml的HCCA溶液样品:用0.1%TFA或者TA30溶解样品制备:1.取0.5-1µl的样品溶液，点在Anchorchip靶上，自然干燥2.取1µl基质溶液点在样品上，自然干燥AnchorChip校正品制备:1.用125µlTA30溶解一管PeptideCalibrationStandardII2.按1:200的比例，用上述基质溶液稀释多肽标准品3.取0.5µl稀释后的多肽标准品点在AnchorChip标准品位置上适合于多肽，蛋白酶解产物分析样品不能含有碱金属盐、表面活性剂和其他已知的能干扰MALDI分析的污染物.如果有这些污染，请先用磁珠、ZipTips、透析或类似的方法去除它们.HCCA,drieddroplet适用于混合蛋白的LC-MALDI分析(usingtypicalnanoLCflowratesof300nl/min)nanoLC馏分点靶:基质溶液配制:-748µlTA95-36µlHCCA在TA90里的饱和溶液-8µlTFA10%水溶液-8µl100mMNH4H2PO4水溶液如果每15秒收集一个点，蠕动泵流速100µl/h如果每10秒收集一个点，蠕动泵流速150µl/h也就是说，每个点的绝对量(基质溶液+馏分)差不多420纳升.校正品制备:1.用125µlTA30溶解一管PeptideCalibrationStandardII2.按1:200的比例，用上述基质溶液稀释多肽标准品3.取1µl稀释后的多肽标准品点在AnchorChip标准品位置上样品靶:AnchorChipStandard(800µm)2,5-DHB,drieddroplet适用于多肽、磷酸化/糖蛋白酶解产物、整蛋白、多糖分析样品靶:Groundsteel基质溶液配制:用TA30配制20mg/ml的2,5-DHB基质添加剂:1%H3PO4(分析磷酸化多肽).1mMNaCl(分析多糖)样品:用0.1%TFA或TA30溶解。对多糖，用水溶解样品制备:1.取1µl样品和1µl基质均匀混合，2.取1µl混合溶液点在样品靶上，自然干燥2,5-DHB,drieddroplet适用于多肽、糖蛋白酶解产物、多糖分析样品靶:AnchorChipStandard800基质溶液配制:用TA30配制20mg/ml的2,5-DHB基质添加剂:1mMNaCl(分析多糖)样品:用0.1%TFA或TA30溶解。对多糖，用水溶解样品制备:1.取1µl样品点在AnchorChip靶上，自然干燥2.取1µl基质点在样品靶上，自然干燥2,5-DHAP,drieddroplet适用于蛋白质分子量分析样品靶:Groundsteel基质溶液配制:1.用375µl乙醇溶解7.6mg2,5-DHAP2.加入125µl的18mg/ml柠檬酸氢二铵水溶液3.涡旋混匀1min，超声15min，涡旋混匀1min。样品:用0.1%TFA溶解样品制备:1.取2µl样品、2µl2%的TFA和2µl基质溶液混合2.用枪头反复吹打，直到看到结晶3.取1µl晶体悬浊液点在样品靶上SA,doublelayer适用于蛋白质分子量分析样品靶:Groundsteel基质溶液I配制:SA在乙醇中的饱和溶液基质溶液II配制:SA在TA30中的饱和溶液样品:用0.1%TFA溶解样品制备:1.去1µl基质溶液I点在样品靶上，形成基质薄层2.1µl基质溶液II和1µl样品均匀混合3.取1µl混合溶液点在基质薄层上sDHB,drieddroplet适合于整蛋白和ISD分析样品靶:Groundsteel基质溶液配制:用TA50配制50mg/ml的sDHB溶液样品:用0.1%TFA或者TA30溶解样品制备:1.取1微升样品和1微升基质均匀混合，2.取1微升混合溶液点在样品靶上，自然干燥1,5-DAN,drieddroplet适合于ISD分析样品靶:Groundsteel基质溶液配制:用TA50配制1,5-DAN的饱和溶液注意：1.基质溶液一定要新配，2.1,5-DAN有毒样品:用0.1%TFA或者TA30溶解样品制备:1.取1微升样品和2微升基质均匀混合，2.取1微升混合溶液点在样品靶上，自然干燥3-HPA,drieddroplet适用于寡核苷酸分析样品靶:Groundsteel基质溶液配制:先用50:50的水和乙腈溶解柠檬酸氢二铵，浓度10mg/ml再用上述溶液溶解3-HPA，得到饱和溶液样品:用水溶解样品制备:1.取1微升基质溶液点在样品靶上，自然干燥。2.取1微升样品溶液，点在基质上。让其自然干燥。3-HPA,drieddroplet适用于寡核苷酸分析样品靶:AnchorChipsmall(400µm)基质溶液配制:先配制1mg/ml的柠檬酸氢二铵水溶液然后用该溶液溶解基质，浓