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选修1生物技术实践细菌培养基LB（Luria-Bertani)液体培养基酵母提取物0.25克蛋白胨0.5克氯化钠0.5克将上述物质溶解后，添加自来水，定溶至50mL。一、培养基LB固体培养基需加琼脂1克1、培养基的配制原则(1)目的要明确根据种类、目的配制(2)营养要协调(3)pH要适宜如细菌：pH6.5~7.5真菌(如霉菌)：pH5.0~6.02、细菌培养基的制备：培养基的配制灭菌搁置斜面称量溶化调pH分装加棉塞包扎什么叫灭菌？什么叫消毒？为什么要灭菌？若混有杂菌，将与菌种形成竞争关系，影响菌种的生长或不能分离到所需的微生物。灭菌是指用物理或化学方法，杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子的方法。二、灭菌操作消毒是指用物理或化学方法，杀死病原菌的方法。在培养微生物时必须进行无菌操作无菌操作的要求:(1)各种器皿必须是无菌的(2)各种培养基必须是无菌(3)转移操作及其它环境也应是无菌的灭菌的方法(1)干热灭菌(火焰灼烧)(2)高压蒸汽灭菌(在1kg/cm2压力的高压蒸气锅中(121℃)灭菌15min。)(3)过滤灭菌法（G6玻璃砂漏斗）(4)紫外光灭菌法(5)化学药剂灭菌法（如70%~75%酒精等）实验操作前，实验用具放在超净台上，以紫外灯和过滤风灭菌30min。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，可在90℃以上(500g/cm2压力)的高压蒸气锅中灭菌30min。有些不能加热灭菌的化合物，如尿素，可用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌。灭菌或消毒对象接种环等金属或某些玻璃用具手培养基试管、培养皿、三角瓶等超净台灭菌或消毒方法火焰灼烧70%~75%酒精高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌紫外光和过滤风三、细菌的分离1、划线分离法方法：用烧红后冷却的接种环蘸取带菌的培养物，在固体培养基的平板上划线。分离划线法连续划线法2、涂布分离法方法：将培养的菌液稀释，通常稀释10-5~10-7倍。取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基的平面上，然后进行培养。在某个稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。划线分离法：方法简单。涂布分离法：单菌落更易分开，但操作复杂些。单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。实验1大肠杆菌的培养和分离一、实验内容1、用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌。2、在固体平面培养基上划线进行分离。大肠杆菌和革兰氏染色大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。二、设备及用品灭菌锅、三角瓶、封口膜和橡皮圈（或棉塞）、培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性手套、酒精棉球、镊子、有棉塞的试管等。三、实验材料1、LB培养基（液体和固体）2、大肠杆菌菌种斜面3、空白斜面将装有LB液体和固体培养基的三角瓶，加上封口膜（或棉塞）。将培养皿用牛皮纸包好，一起放入高压灭菌锅内，1kg/cm2压力（121℃），灭菌15min四、实验步骤灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上1、为什么用棉塞而不用橡皮塞？棉塞（封口膜）能防止杂菌污染，又保证通气良好。2、高压蒸汽灭菌以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？3、灭菌完毕后，如果压力未降至零，就打开气阀，会出现什么现象？为什么？如果灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升至98kPa（1kg/cm2压力）时，锅内的温度就不会上升到应有的高度（121℃），导致灭菌不彻底。如果压力未降到零就打开气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸气灭菌锅内外压力不平衡的缘故。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上4、固体培养基冷却至60℃左右才能用来倒平板。用什么方法来估计培养基的温度？用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉有些热又不烫手时。5、为什么需使锥形瓶瓶口通过火焰？通过烧灼灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上将三角瓶内的固体培养基倒入培养皿中，使之置于水平位置，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，凝固后即可形成平面。6、接种操作为什么要在火焰旁进行？空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌的区域，在这里操作，可以避免杂菌的污染。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上在酒精灯火焰旁，用灭菌的接种环将菌种接种到三角瓶内的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h。7、如何使接种环冷却后再挑取菌体？为什么要冷却？让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。以免接种环温度太高,杀死菌种。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上在酒精灯火焰旁，用灭菌的接种环蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，将培养皿倒置，37℃恒温培养箱中培养24h。8、为什么在操作的第一步要灼烧接种环？为了避免接种环上可能存在的微生物造成污染。9、若用分离划线的方法，为什么每次划线前都要灼烧接种环？及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上10、为什么在划线操作结束时仍需灼烧接种环？为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使一次划线时，接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目减少，以便得到单菌落。11、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸汽所凝结的水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上12、接种斜面画线时要注意什么？(1)由里向外画，(2)线条要细且密；(3)不要重复划线，(4)不要画破培养基，不要接触到管壁或管口。13、在什么条件下培养细菌？恒温箱中，在37℃下培养24小时。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上在酒精灯火焰旁，将单菌落用灭菌的接种环取出，用划线法接种在斜面上，37℃恒温培养箱中培养24h后,置于4℃冰箱中保存。14、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快捷。(2)注意灭菌原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间。(3)注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上15、培养后如何判断是否有杂菌污染?(1)从菌落形态看：细菌菌落：表面一般光滑而湿润，有黏稠性，多数透明或半透明。放线菌菌落：表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状，常有不同颜色，菌丝可深入到培养基内。霉菌菌落：为绒毛状，孢子有各种颜色。(2)用显微镜镜检，观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子等。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上16、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理?所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。17、如果分离的是转基因工程的工程菌，如何保证没有被普通的大肠杆菌污染?因转基因用的质粒通常是经过改造的质粒，具有某种抗性基因。可用含某种相应抗生素的培养基培养。灭菌倒平板接种至液体培养基中划线分离接种至斜面上实验4果汁中的果胶和果胶酶1、果胶一、果胶和果胶酶的基础知识•果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，起着将植物细胞粘合在一起的作用。它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物(含半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯)，不溶于乙醇。会减少水果组织的分散性，故在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，通常包括果胶酸酶（多聚半乳糖醛酸酶）、原果胶酶和果胶甲酯水解酶等。2、果胶酶•去掉果胶，植物组织变得松散，利于榨取果汁。作用：果胶酶分解果胶，瓦解细胞壁和胞间层，使榨取果汁变得更容易，提高水果的出汁率。果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使浑浊的果汁变得澄清。来源：有些微生物如黑曲霉、苹果青霉等都可用于生产果胶酶。二、实验内容1、探究利用苹果匀浆制作果汁的最佳条件。2、检测果胶酶的活性。3、了解果胶酶对果汁形成的作用和收集果胶酶的应用材料。三、设备及用品匀浆机、小刀、烧杯、水浴锅或酒精灯、试管、移液管、量筒等。四、实验材料1、山楂或苹果2、黑曲霉提取液或2%果胶酶溶液3、95%的乙醇五、实验步骤•1、将苹果洗净、切开，去皮、籽、柄，切成小块，将切成小块的苹果放入匀浆机中，榨取苹果汁•2、将榨取的苹果汁倒出，用双层纱布过滤后装入烧杯中备用。+4ml苹果汁+45℃保温15分钟121ml果胶酶++34+沸水浴4ml苹果汁+45℃保温15分钟1ml果胶酶4ml苹果汁+45℃保温15分钟1ml蒸馏水沸水浴4ml苹果汁+45℃保温15分钟1ml蒸馏水1234+2ml乙醇+静置10分钟121ml1号管上清液++34+12342ml乙醇+静置10分钟1ml2号管上清液2ml乙醇+静置10分钟1ml3号管上清液2ml乙醇+静置10分钟1ml4号管上清液1234烧杯号试管号处理加酒精前现象加酒精后现象A(加酶)1加热2不加热B(加水)3加热4不加热分层十分明显，沉淀浓缩成一小团，果汁澄清度(++++)分层十分明显，不如1号试管澄清度(+++)液体浑浊，比4号稍澄清度(++)。液体浑浊，澄清度(+)果汁被稀释沉淀物(+)果汁被稀释沉淀物(++)产生絮状沉淀沉淀物(+++)产生大量絮状沉淀沉淀物(++++)12341234六、实验结果另取试管做七、实验原理1、果胶酶能使果胶完全水解成半乳糖醛酸，增加固形物的分散度，降低水果匀浆的黏度，使果汁澄清。2、果胶不溶于乙醇，加乙醇能使果胶析出。1.影响果胶酶降解果胶的因素①温度②pH值③酶作用时间④酶的用量⑤酶抑制剂等等八、问题讨论2.设计实验，探究果汁制作中果胶酶催化的最适温度。3.设计实验，探究果汁制作中果胶酶催化的最适pH。用滤出的苹果汁的体积大小或果汁的澄清度来判断果胶酶活性的高低。自变量、因变量、无关变量分别是什么？如何控制自变量和无关变量？观察指标是什么？混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理。4.设计实验，探究果汁制作中果胶酶的最佳用量。自变量、因变量、无关变量分别是什么？如何控制自变量和无关变量？观察指标是什么？5.果胶酶还可能有什么作用？果胶酶除用于制备果汁外，还用于果酒澄清，还可作为洗衣粉的添加剂（除去衣服上的果汁、果酱等）。6.果胶酶水解果胶的最终产物是什么？要使果汁澄清，应该使用果胶酶和果胶甲酯酶中的哪一种？还是同时使用？为什么？这样才能使果胶完全水解成半乳糖醛酸，增加固形物的分散度，降低水果匀浆的黏度，有利于过滤掉不溶物，使果汁澄清。应同时使用。果胶酶水解果胶的最终产物是半乳糖醛酸。实验5加酶洗衣粉的使用条件和效果表面活性剂有离子型和非离子型两种类型。离子型又可分为阳离子型和阴离子型。一、基础知识一般的家用洗衣粉和其他各种家用洗涤剂的成分基本相同，主要含有表面活性剂、水软化剂、碱剂、漂白剂和香精等成分。洗衣粉中主要含阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠，有的也加入非离子型表面活性剂如脂肪醇聚氧乙烯醚。表面活性剂种类表面活性剂能优先吸附在各种界面上,起到降低表面张力、改变体系界面状态的作用。表面活性剂中含有疏水基团和亲水基团，在洗涤过程中有乳化作用和通透作用，使衣服中的脂肪类物质进入水中。表面活性剂作用加酶洗衣粉就是在普通洗衣粉中，加入0.2％～0.5％的酶制剂制成的。在洗衣粉中添加的酶的种类很多，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等。其中蛋白酶多用枯草杆菌碱性蛋白酶。加酶洗衣粉添加的酶二、实验内容1、探究加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤效果的区别。2、用加酶洗衣粉洗涤沾有鸡血的棉织品，观察不同温度下的洗涤效果。三、设备及用品三角瓶、镊子、水浴锅、沾有鸡血的棉布等。四、实验材料加酶洗衣粉和不加酶洗衣粉+100ml水+40℃水浴保温120.5g加酶洗衣粉3摇匀沾有鸡血的棉布搅拌或摇动+观察洗涤效