建库测序流程表

博昊云天医学检验实验室文件编号：BHYT-4-107/03版本/修订号：A/0主题内容游离DNA文库制备及测序流程记录表生效日期：20190918第1页共8页一、血浆分离、游离DNA抽提区步骤操作内容备注试剂区1.DNA提取试剂配制□蛋白酶K+磁珠：提前30分钟恢复到室温。配制裂解液：裂解液（20ml）瓶中加入14ml异丙醇，颠倒混匀，室温存放。要充分混匀配制清洗液清洗液1：用前加入25ml无水乙醇，颠倒混匀，室温存放。清洗液2：用前加入64ml无水乙醇，颠倒混匀，室温存放。2.蛋白酶K和磁珠的分装□1.2ml浅孔板，排枪加：10µL混匀蛋白酶K14µL混匀磁珠先加入蛋白酶K，后加入磁珠，加磁珠时要注意混匀。样本制备区11.消毒□移液器、离心机、生物安全柜，试验台的消毒，75%酒精喷洒、擦拭。2.低速低温分离血浆□4℃，1600g离心10分钟，安全柜内分离血浆,每个样本分离出5管：3×1.6ml血浆管（其中2管用于储存），1.6ml白细胞层储存管（混匀分装2×0.8ml）,3.高速低温分离血浆□1.6ml血浆实验管，4℃，16000g离心10分钟，由后向前依次转入对应的样本号管内（每管1.6mL），-80℃保存血浆和血细胞管。4.加血浆□1.2ml浅孔板对应孔内各加入200µL高速离心分离的血浆上清。质控：阳性、阴性、空白、已检阳性。5.加裂解液并混匀□排枪加裂解液280µL/孔(2×140µL)，每3分钟混匀一次（吹打15次），混匀次数〉3次。共15分钟，注意实验室温度的影响。6.磁力分离□置于磁力架上5分钟至澄清，弃上清7.清洗□7.1清洗1：用排枪加入320µL（2×160µL）清洗液1，吹打6次，置磁力架30s至澄清，弃上清。7.2清洗2：使用清洗液2，操作流程同7.1。7.3清洗3：重复7.2.清洗3结束后要充分弃除残液并室温晾干（使用手电筒观察磁珠表面无反光现象即为晾干）。8.洗脱获得核酸溶液□下磁力架，加42µL洗脱液，吹打6次，室温5分钟，上磁力架至澄清。若直接进行建库则将40µL上清直接转入装有末端修复的PCR板或八连排；若就此停止则转入PCR板或八连排备用。配制阴/阳对照：按1.5µL原样+38.5µL纯水封板，可暂存于-20℃博昊云天医学检验实验室文件编号：BHYT-4-107/03版本/修订号：A/0主题内容游离DNA文库制备及测序流程记录表生效日期：20190918第2页共8页二、末端修复区步骤操作内容备注试剂区1.试剂解冻□试剂盒内试剂室温融化，混匀瞬离酶，放冰盒待用。其它组分室温解冻，震荡混匀离心，冰上待用。2.在冰上配制并分装末端修复反应混合液□配制人份用量（1.5mlEP管，多配10%人份富余量）：ERATBufferMixμlERATEnzymeMixμlMIX垫手混匀并分装至PCR板/八连排中备用。每人份用量10ul：ERATBufferMix：9.4μERATEnzymeMix：0.6μ样本制备区11.加样本□将提好的DNA与配置好的阴/阳对照转入装有10µL末端修复MIX的PCR板或八连排中并吹打混匀，确认液面无异常后封膜离心，进行末端修复。反应体系：50µL。2.设置修复条件热盖70℃，37℃（10min）→65℃（15min）→4℃（Hold）3.末端修复反应结束瞬离，收集反应液至管底。末端修复产物可以放在-20℃过夜，但产量会下降20%。三、接头连接区步骤操作内容备注试剂区在冰上配制接头连接反应混合液□配制人份用量（1.5mlEP管，多配10%人份富余量）：LigationBufferMixµLLigationEnzymeµLMIX枪混或垫手混匀。每人份用量：连接缓冲液Mix24µL连接Enzyme1µL样本制备区11.加接头□在DNA末端修复好的PCR板或八连排（50µL）中加入5µL对应的AdaptersMix(Barcode01-48)2.加接头连接混合液加入25µL配制好的接头连接反应混合液。吹打混匀，确认液面无异常后封膜离心。反应体系80μl含PEG，粘稠，需缓慢吸取。3.设置连接条件□热盖OFF，23℃（20min）→4℃（Hold）4.接头连接反应结束□瞬时离心（八连排可用掌上离心机）。连接产物可以放-20℃过夜，但产量会下降。博昊云天医学检验实验室文件编号：BHYT-4-107/03版本/修订号：A/0主题内容游离DNA文库制备及测序流程记录表生效日期：20190918第3页共8页四、连接产物纯化与PCR扩增体系建立区步骤操作内容备注试剂区纯化试剂准备□提前30min取出纯化珠于室温，并装40µL/孔于1.2mL浅孔板中备用。在冰上配PCR反应混合液□配制人份用量：PCREnzymeMix：µLPCRPrimerMix：µLMIX枪混并分装至PCR板或八连排中。每人份用量29µL：PCREnzymeMix25µLPCRPrimerMix4µL样本制备区11.磁珠纯化将连接产物转入装有40µL磁珠的1.2mL浅孔板中，轻轻吹打至少10次，完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入管中。2.孵育室温静置10min3.弃上清上磁力架，静置10min，带溶液澄清后弃上清。4.乙醇漂洗浅孔板保持于磁力架上，加入180µL新鲜配制的75%乙醇吹打6次，弃上清5.再次漂洗□重复步骤4，充分弃去残液。6.干燥□室温晾干，约5min,使用手电筒照射磁珠表面无反光即为干燥。7.洗脱□向浅孔板中加入23µL洗脱缓冲液，浸湿磁珠，下架，反复吹打混匀至溶液呈均一状态。8.孵育□室温10min，每5min进行一次吹打混匀。9.移入PCR管□置于磁力架上至澄清，取21µL上清液，加入到配制好的PCR反应液中，反复吹打混匀，反应体系50µL。停止点：连接产物纯化后可置-20℃冰箱储存。10.转实验区□通过室内传递窗转运到扩增区1博昊云天医学检验实验室文件编号：BHYT-4-107/03版本/修订号：A/0主题内容游离DNA文库制备及测序流程记录表生效日期：20190918第4页共8页五、PCR扩增区步骤操作内容备注扩增区11设置PCR条件热盖105℃，98℃2min1循环98℃15s→56℃15s→72℃30s12循环72℃5min1循环4℃Hold2转实验区扩增管经过道传递窗转运到扩增区2。扩增区不能有开管操作六、文库的纯化区步骤操作内容试剂区纯化磁珠的准备□提前30min取出纯化磁珠至室温。使用前充分震荡混匀，排枪分装50µL/孔磁珠至1.2mL浅孔板。可提前把当天要用纯化试剂放在扩增区2冰箱扩增区21..移入纯化板□扩增后的产物瞬时离心，收集反应液至管底。将全部产物分别转移至已分装好50µL纯化磁珠的1.2mL浅孔板中。2.磁珠吸附用带滤芯吸头轻轻吹打至少15次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入管中，静置10分钟。于磁力架吸附10分钟至液体澄清，弃上清。3.乙醇漂洗于磁力架上，加入180µL75%乙醇漂洗磁珠，吹打6次，静置30s后弃上清注意加乙醇时清洗孔壁4.再次漂洗□重复步骤3，充分弃去孔内残液。5.干燥□保持纯化板在磁力架上，室温晾干（使用手电筒照射磁珠表面无反光现象即为干燥）。6.洗脱□保持浅孔板于磁力架上，加32µL洗脱缓冲液浸湿磁珠表面，下架，轻轻吹打混匀，室温静置10分钟，中间5分钟混匀一次。7.移入新管□上架至溶液澄清，吸取30µL上清液转移到新PCR板或八连排中。停止点：PCR纯化后产物，可置-20℃冰箱储存博昊云天医学检验实验室文件编号：BHYT-4-107/03版本/修订号：A/0主题内容游离DNA文库制备及测序流程记录表生效日期：20190918第5页共8页七、DNB制备与质检区步骤操作内容备注试剂区准备试剂□取出环化反应缓冲液、连接酶、DNB制备缓冲液、DNB聚合酶混合液I、DNB聚合酶混合液II、TE缓冲液和DNB终止液、DNB加载缓冲液I、DNB加载缓冲液II，经PCR通道传递窗转移到扩增区2连接酶、DNB聚合酶混合液II、DNA聚合酶混合液存放于﹣20℃，现用现拿。其它试剂4℃解冻。测序试剂板II及DNB加载试剂板常温解冻即可。测序试剂板I、测序试剂板II、DNB加载试剂板、DNA聚合酶混合液、dNTP混合液I、dNTP混合液II于试剂区融化备用，测序芯片室温平衡，DNB加载前经PCR通道传递窗转移至测序区。扩增区2.1.PCR文库质检加样：□1.1dsDNA检测试剂配制：染料工作液配制：荧光染料/buffer=1/199染料分装：定标管S1、S2各分装190µL，样本管各分装198µL。1.2标准品S1、S2各加10µL，对应样本管加样2µL。1.3U盘导出定量结果，按时间排序后导入定量表。要求最终PCR产物文库浓度≥2ng/µL。2.混合文库与环化：pooling变性单链环化反应□2.1根据任务单中DNA文库定量结果，将待测文库根据标签接头编号确定合适的pmoL数进行等质量混合，并使用洗脱缓冲液统一稀释至浓度为3.33ng/μL。2.2取48μL混合文库于PCR管中，置于PCR仪上95℃变性6min，在反应进行到5min处即刻取出PCR管插入碎冰冷却，放入﹣20℃冰箱2~3min后取出。2.3每个PCR管加12.1μL环化反应液，混匀，瞬离5s。反应条件：热盖：Off，体积：60μL，37℃，30min。直接将样本浓度导入任务单的电子表格即可计算出各样本需要用于POOLING的体积。每条lane用量酶：0.5µLbuffer：11.6µL每张芯片用量酶：1.1µLbuffer：25.52µL3.DNB生成□3.1取2.3步骤环化DNA文库20µL（约6ng）到0.2mLPCR管。加20µLDNB制备缓冲液，涡漩混匀，瞬离，置PCR仪反应条件：热盖：105℃，体积：40µL，95℃1min，65℃1min，40℃1min，4℃Hold。3.2当温度达到4℃时取出PCR管，瞬离5s，加40µLDNB聚合酶混合液I和4µLDNB聚合酶混合液II，枪混。瞬离。反应条件：热盖：Off，体积：84µL，30℃20min，4℃Hold。3.3达4℃后立即取出PCR管置冰盒上，即刻加20µLDNB终止缓冲液，阔口吸头滴混5~8次，4℃备用。注意：混匀DNB时一定要用阔口吸头轻柔吹打，剧烈吹打会破坏DNB。终体积：20+20+40+4+20=104µL4.DNB质检□4.1ssDNA检测试剂准备：配制与分装同dsDNA。8ng/µL，重新制备；40ng/µL（不是由于博昊云天医学检验实验室文件编号：BHYT-4-107/03版本/修订号：A/0主题内容游离DNA文库制备及测序流程记录表生效日期：20190918第6页共8页4.2标准品S1、S2各加10µL，对应的样本各加样2µL。4.3浓度8ng/µL~40ng/µL范围内合格。DNB反应时间过长导致），用DNB加载液I稀释到20ng/µL。5.测序的加载准备□5.1准备两个八连排管做好标记。5.2加入32µLDNB加载缓冲液II，和1µLDNB聚合酶混合液II.5.3将上述3.3样本全部转入八连排中，阔口吸头滴混5~8次。经过PCR过道传递窗转移到测序区八、DNB加载区步骤操作内容备注测序区加载□1.清洗DL-50：进行加载前对仪器进行清洗，1~2次，最后一次使用进行预载的底座进行清洗。2.放置芯片：检查全自动样品加载系统垫片、芯片底座是否正常，并将测序芯片安装在芯片底座上，确保上下左右无法晃动。测序芯片反面定位凸起与样品加载系统上的凹槽吻合后卡住芯片。2.放置加载试剂板：揭开试剂板封口膜，放置在加载系统试剂板位（试剂标签粘贴处应朝外）。3．放置测序样品管：将样本放于加载系统指定DNB放置区，选择DNB加载程序Sample2.0，点击开始，等待加载完成。4.加载完成后，保持芯片在加载系统上室温孵育30min。取下芯片，上机测序或存放于4℃冰箱备用。DNB加载过程中切勿移动芯片。九、Halos关联信息导入区步骤内容备注测序区1、导入样本信息表□核对