高速逆流色谱原理及应用

高速逆流色谱技术及应用领域晋晓峰研发部副主管上海同田生物技术有限公司报告内容1高速逆流色谱原理2高速逆流色谱优点3高速逆流色谱应用一、高速逆流色谱原理液－液分配色谱利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊的流体动力学？固定相的保留利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES）从而实现流动相高速移动时固定相的保留混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合静置区：两相溶剂分成两层，重相在外部，轻相在内部以1000转/分的速率进行旋转，在二维力场的作用下分离管柱内混合和传递的频率可达到17次/S，从而实现高效的分离K＝Cs/CmCsCmHSCCC的工作流程二、高速逆流色谱优点不用固态载体的高效液-液分配色谱技术不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100%样品负载能力强，制备量大，重现性好操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件操作简单，无需太多样品前处理三、高速逆流色谱应用高速逆流色谱技术的应用领域1高速逆流色谱在中药现代化中的应用2高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用3高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用4高速逆流色谱在食品行业中的应用5高速逆流色谱在化学合成中的应用6高速逆流色谱在生物领域中的应用7高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用高速逆流色谱在中药现代化中的应用成药质量控制指纹图谱指导原药材种植/GAP基地建设单体化合物用于制药中间体的质量控制实例1大黄有效成分的分离01002003004005002004006008001000VIVIVIIIIIIAbsorbance(mV)Time/min0102030400100200300400500600physcionchrysophanolemodinrheinaloe-emodincinnamicacidAbsorbance(mAU)Time/minHSCCC条件：固定相：乙醚流动相：1%NaH2PO4-1%NaOH梯度洗脱(500min内,由100:0-0:100)流速:2.0mlmin-1转速：800rpm样品量：120mg粗提物固定相保留：40%机型：TBE-300AⅠ：rhein（大黄酸）19mgⅡ:cinnamicacid（苯乙烯酸）19mgⅢ:emodin（大黄素）18mgⅣ:aloe-emodin（芦荟大黄素）14mgⅤ:chrysophanol（大黄酚）10mgⅥ:physcion（大黄素甲醚）6mg纯度均在98％以上JournalofChromatographyA,2004,Volume1052,Issues1-2,Pages217-221HSCCC在分离中药单体中的应用（蒽醌类）实例2蛇床子有效成分的分离HSCCC条件：溶剂系统:石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水流动相：梯度洗脱0-150min:5:5:5:5下相150-250min:5:5:6:4下相250min后:5:5:6.5:3.5下相流速:2.0mlmin-1转速：800rpm样品量：150mg粗提物机型：TBE-300A固定相保留：60%Ⅰ：花椒毒素95.0％7.6mgⅡ:异茴芹素99.6％7.6mgⅢ:佛手苷内酯99.7％9.7mgⅣ:欧前胡素100％60.5mgⅤ:蛇床子素100％50.6mgⅥ:未知化合物98.1％10.2mg051015202530350200400600800UnknownOstholeImperatorinBergaptenIsopimpinellinXanthotoxinAsorbance(mAU)Time(min)01002003004005002004006008001000VIVIVIIIIIIAbsorbance(mV)Time(min)JournalofChromatographyA,2004,Volume1055,Issues1-2,71-76HSCCC在分离中药单体中的应用（香豆素类）JournalofChromatographyA,1102(2006)44-50实例3白花败酱异戊烯基黄酮的分离溶剂系统:正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水(5:6:6:6)流动相：下相流速:1.0-2.0mlmin-1转速：850rpm样品量：400mg粗提物固定相保留：65%分离温度:25C机型：TBE-300AⅠ:orotinin（牡荆苷）99.2％38.2mgⅡ:orotinin-5-methylether98.5％19.8mgⅢ:licoagroachalconeB97.6％21.5mgHSCCC在分离中药单体中的应用(黄酮类)实例4吴茱萸生物碱的分离溶剂系统:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:5)流速:2.0ml/min转速：900rpm样品量：180mg粗提物固定相保留：50%机型：TBE-300AⅠ:吴茱萸碱98.7％28mgⅡ:吴茱萸次碱98.4％19mgⅢ:吴茱萸新碱96.9％21mgⅣ:1-methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone.98.0％16mgⅤ:1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone97.2％12mg01020304050600200400600800A1-Methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone1-Methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinoloneEvocarpineRutaecarpineEvodiamineAbsorbance(mAU)/254nmTime(min)01002003004005006002004006008001000VIVIIIIIIAbsorbance(mV)/254nmTime(min)J.Chromatogr.A,2005,vol1074/1-2pp.139-144HSCCC在分离中药单体中的应用（生物碱类）芦荟苷B芦荟苷A芦荟未知物芦荟提取物HSCCC分离图谱丹参提取物的HSCCC分离图谱丹酚酸B沙棘提取物的HSCCC图谱异鼠李素山奈酚槲皮素-10.00033.60077.200120.800164.400208.0000.0024.0048.0072.0096.00120.00144.00168.00192.00216.00240.00[mv][min]高车前素未知物泽兰黄酮荔枝草提取物的HSCCC图谱小结：HSCCC在中药中各类单体的制备均有应用，经过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）后直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替代的分离方法。HSCCC在中药指纹图谱中的应用中药指纹图系指中药经适当处理后，采用一定的分析手段（光谱和色谱）得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法2000年8月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹图谱标准，美国FDA及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷（比如HPLC法前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特征）高速逆流色谱法是中药指纹图谱发展的一个新方向02040608010012014001234567891011121314Time(h)Absorbance(OD280nm)0102030400100200mAU(280nm)Time(min)01020304004080120160mAU(280nm)Time(min)0102030400100200mAU(280nm)Time(min)B1B2B305010015020025001234567891011121314Time(h)Absorbance(OD280nm)02040608010001234567891011121314Time(h)Absorbance(OD280nm)A1A2A3HSCCC图谱HPLC图谱不同产地丹参提取物实例溶剂体系：石油醚-丙酮-水（3:3:2,v/v）样品：250mg环孢菌素粗品检测条件：ELSD环孢菌素A－98.6%，90.2%(收率)环孢菌素C－99.3％，85.0%(收率)环孢菌素B－98.7％，88.5%(收率)环孢菌素D－98.5％，86.3%(收率)实例1环孢菌素粗品HSCCC在抗生素分离纯化中的应用溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.5％氨水（3:7:5:6,V/V），检测器：ELSD；进样量：300mg红霉素A和C含量均在98％以上实例2红霉素HSCCC在抗生素分离纯化中的应用实例1藤黄酸异构体的分离溶剂系统:正己烷-甲醇-水(5:4:1)流动相：下相流速:2.0mlmin-1转速：900rpm样品量：50mg固定相保留：50%分离温度:25CA.gambolicacid97.2%B.epigambolicacid97.5%闭合回路系统JournalofChromatographyA,2006,Volume1127,298-301HSCCC在异构体分离纯化中的应用实例1利用HSCCC分离标准蛋白质混合物010020030002468Signal(mV)Time(min)123溶剂体系：PEG1000-磷酸盐体系-水＝14-16-70(%,w/w)样品：1mg细胞色素C、20mg溶菌酶、5mg血红蛋白1.CytochromeC;2.Lysozyme;3.Hemoglobin(反转出峰，上相为流动相)色谱，2005,Vol.23No.112～17HSCCC在蛋白质分离纯化中的应用溶剂体系：PEG1000-磷酸二氢钾-水＝15-17-68(%,w/w)样品：1mg细胞色素C、8mg肌红蛋白、20mg溶菌酶1.CytochromeC;2.Myoglobin3.Lysozyme实例2利用HSCCC分离标准蛋白质混合物HSCCC在蛋白质分离纯化中的应用从上面这些实例可以看出，HSCCC作为一种高效的液液分配色谱，拥有广阔的应用空间。地址：上海市张江高科技园区爱迪生路326号邮编：201203Tel:[phone]Fax:[phone]Cellphone:15921427497E-mail:[e-mail]