狂犬病实验室检测技术

1狂犬病实验室检测技术2•一、实验室操作前的要求及准备•二、实验室检测方法3实验室操作前的要求及准备•（一）实验室条件及生物安全操作要求•（二）检测标本的要求•（三）实验前准备4（一）实验室条件及生物安全操作要求•1、暴露前免疫工作人员需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。•2、P2实验室操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3实验室内进行(实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。•3、P3实验室对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。•没有P3实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。5•4、个人防护实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套，作好技术上的准备。•5、防止气溶胶扩散由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。•6、实验后消毒处理实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。6•1、采集时间（1）应尽量采集较新鲜的标本。（2）采集时无菌操作，避免标本污染•2、标本保存（1）尽量低温保存（2）存放于无菌离心管中并进行编号。•3、标本类型（1）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。（2）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于病原学检测，其中以脑组织中的阳性率最高；血清和脑脊液可用于抗体的检测。（二）检测标本的要求7（三）实验前准备•1、实验室及仪器的准备（略）•2、各种试剂及材料的准备（略）8实验室检测方法•（一）DFA法•（二）巢式PCR法•（三）其它检测方法•（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法•（五）美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法9（一）DFA法（直接荧光抗体法）——检测狂犬病毒抗原免疫荧光技术Ab优点Ag(尤其是不产生细胞病变的病毒安全快速简便敏感性和特异性较高10荧光抗体的染色方法可分为两类：•直接法—荧光抗体直接与标本内的抗原反应,优点简便、快捷、有效减少非特异性染色,只适用于检测细胞内的抗原；•间接法—荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应,既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体相对直接法操作步骤增多•DFA原理：抗体蛋白分子++抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原荧光素11操作：1、材料和仪器2、操作步骤•i.印片：用酒精浸泡载玻片30分钟后取出、吹干，分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上；•ii.固定：吹干后，取冷丙酮（4℃）室温固定7～10分钟；取出吹干，进行步骤3，或置于－70℃冰箱保存；•iii.加荧光抗体：将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上（如果从冰箱中取出，则待雾气散掉后再进行此步骤。）；12•iv.孵育：将抗原片放在湿盒中，37℃温育30分钟；•v.洗片：取出后，用缓流冲洗抗原片3～5秒，再用PBS振洗2遍，蒸馏水振洗1遍，每次2分钟，吹干；•vi.封片镜检：用90％甘油（PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。搅拌器及染色缸13结果判断：仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：阴性、可疑、＋~＋＋＋＋•－：无荧光；•＋/－：极弱的可疑荧光；无荧光“－”14•＋：荧光较弱，但清晰可见；15•＋＋：荧光明亮，且多个视野均有分布；16•＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰，且范围广泛；荧光强度“＋＋＋”荧光强度“＋＋＋＋”1718（二）巢式PCR方法——检测狂犬病毒核酸传统的PCR检测模式一般需要三个步骤：•制备模板：对待测标本进行核酸（DNA或RNA）提取•扩增过程：采用PCR或RT-PCR技术对核酸进行变性、退火、延伸扩增；•检测过程：通过电泳等方法对PCR产物进行检测。SampleExtractRNAorDNAPCRElectrophoresisphotograph19巢式PCR（nested－PCR）：•巢式PCR的原理：是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。•通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。•优点：•特异性、灵敏度均比常规PCR好。•缺点：•比常规PCR易污染。20巢式PCR方法的操作：1、RNA提取：Trizol法•（1）以下步骤在P2生物安全柜中进行取不同位置的少量脑组织（50-100mg）＋1000μlTrizol先加200μl（研磨均匀）然后加满至1000μl[液体（唾液、尿液等）取250μl＋750μlTrizolLS]↓-70℃过夜或颠倒Epp管30～40次以便充分混匀内容物，室温放置5分钟（此步完可-70℃保存1个月）21•（2）以下步骤可在普通实验室进行-70℃取出，室温融化→加200μl氯仿，快速颠倒Epp管数次（30秒），使其呈淡粉红色↓室温放置3min↓4℃离心，12000rpm，15min（其间标记新的离心管，每管中加600μl异丙醇）↓取离心后水相600μl，加入新的离心管中，轻柔混匀↓室温放置10min（－20℃放置30分钟效果更佳）↓4℃离心，12000rpm，10min↓22缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，可见少量沉淀↓加1ml75％乙醇（DEPCH2O新鲜配制）洗涤沉淀↓4℃离心12000rpm，10min↓缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，室温干燥数分钟（加入75％乙醇至－70℃可长期贮存1～2年）↓脑组织的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2个EPP管分装)[液体（唾液、尿液等）的沉淀溶于35ulDEPCH2O中]↓直接进行逆转录或－70℃贮存23•注意事项：•1.操作时一定戴口罩手套，保证离心管枪头无RNA酶•2.一次提取核酸，样本数不要太多（10个左右）•3.加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确，否则容易降低提取效率•4.异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果•5.加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔，加液体时贴壁缓流，以免破坏到所提核酸•6.尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间，水溶的RNA一定要低温保存•7.标本及时放回-20℃或-70℃242、逆转录合成cDNA1）pd(N)6稀释至0.2ug/ul2）水浴预热至65℃（其间标记反应管）3）33ulRNA液65℃水浴10min（其间准备冰盒或碎冰）4）冰浴2min，瞬时离心。5）将液体转移至试剂盒反应管中32ul，先不要混匀。6）再向反应管中加入1ulpd(N)60.2ug/ul或特异引物各0.5ul，使总体积达到33ul，室温1min，混匀，瞬时离心。7）37℃水浴，60min8）-20℃或-70℃保存cDNA253、巢式PCR：2627琼脂糖凝胶电泳•1．电泳槽中注入缓冲液TAE•2．将做好的琼脂胶放入电泳槽（加样孔在负极方向）•3．Marker加5ul，样品加10ul•5．电压：100V•6．时间：30min照相：凝胶成像仪/紫外透射仪28（三）其它检测方法1、ELISA——检测抗原：•包被抗体：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；•封闭：用含0.3％牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；•加待检标本：将采集到的标本研磨，用pH7.4PBS制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200μl/孔，37℃孵育1小时；•洗板：洗板四次；•加酶标抗体：后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时；•洗板：同上；•加底物：加入酶反应底物，室温作用30分钟；•终止反应：加2MH2SO4终止反应；•观察结果：肉眼观察或酶标仪测定结果。292、荧光灶抑制试验——检测中和抗体中和抗体：•为疫苗免疫力程度的评判指标•中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护快速荧光灶抑制试验（RFFIT）：为WHO推荐的检测方法•制备细胞悬液(1×10cells/ml的BSR细胞悬液)↓稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS株）↓中和血清和病毒(0.1ml血清和标准病毒稀释液0.1m1，37℃中和1.5小时)↓检测剩余病毒(每孔加入50µl制备好的细胞悬液，37℃、5%C02过夜培养)↓固定(弃掉培养液，PBS洗一次，丙酮固定)↓荧光抗体检测(干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37℃30分钟)↓观察结果(PBS洗3次，荧光显微镜观察结果)↓计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制≥50％的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度)步骤303、病毒分离A.细胞培养法——分离病毒•研磨标本→制成悬液（用PBS或MEM，30％）→离心（4℃2000r/min离心20m）→取上清接种细胞（鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞）→吸附（2h）→加维持液→孵育(37℃、5％C02、4～5天)→鉴定B.乳小白鼠接种法——分离病毒•研磨标本→制成悬液→离心→取上清接种乳鼠脑内（1～2日龄）→饲养→观察发病情况(未发病的鼠保留至21天后作DFA检测)314、ELISA——检测狂犬病毒抗体•ELISA方法测定的是总抗体，•不代表具有保护性的中和抗体水平•其结果仅供参考。5、染色镜检——检测内基氏小体32（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法1、DFA法——检测狂犬病毒抗原•意义：阳性结果，表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。2、ELISA——检测狂犬病毒抗原•意义：检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法——分离狂犬病毒•意义：阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。334、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸•原理：狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成一条cDNA链（RT）,再进行PCR。•检测步骤：1）病毒RNA的提取2）逆转录合成cDNA3）PCR扩增4）电泳•意义：阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。345、狂犬病特异性抗体检测•狂犬病特异性抗体：在自然感染情况下，狂犬病毒→通过带有病毒的动物唾液→进入机体伤口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流）→故不能形成病毒血症。在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应（针对狂犬病毒）。晚期，狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。因此，通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，只在临床疾病的晚期出现。35A.快速荧光灶抑制试验（RFFIT）——测定中和抗体•意义：•中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护B.ELISA——检测狂犬病毒抗体•意义：1）接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/ml，表明已获得一定的保护。2）未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/ml，且近期有4倍增高，可考虑狂犬病。3）部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。36（五）美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法1、DFA——检测狂犬病毒抗原•当以下情况发生时，需要重复（证实性）检测:1）包涵体颗粒典型，但视野不到10％，或视野大于10％，但抗原分布极度稀疏（如每个视野中只有1到2个包涵体颗粒）；2）包涵体颗粒典型，但染色强度较弱且缺乏特征性；3）包涵体颗粒不典型，但染色强度好（如结构大小均匀、形态规则）；4）非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色；5）两种试剂的检测结果或两个技术人员的结果判定不一致。•当进行重复性确证性DFA检测时，通常采用两种以上的检测试剂进行同比实验。372、RT-PCR——检测核酸3、细胞培养法——分离病毒：鼠神经瘤细胞（MNA）•目的：从未知的脑悬液中分离狂犬病毒，作为DFA检测之外的另一种确证性检测•结果解释：•分离到狂犬病毒，结果为阳性。•传代2次后分离不到狂犬病毒，结果为阴性。•注：如果检测到稀疏的病毒