非小细胞肺癌EGFR基因突变检测

非小细胞肺癌EGFR基因突变检测主要内容EGFR检测的背景及意义EGFR检测的标本类型EGFR检测的临床开展及成功关键肺癌精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合精确诊断靶向治疗分子靶点药物EGFR吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、CO-1686,AZD9291ALK克唑替尼、AlectinibMetTivantinib(ARQ197),Onartuzumab(MetMab)Cabozantinib(XL184)FGFR1Nintedanib,XL999HER-2阿法替尼RET/ROS融合基因克唑替尼,AP26113,ASP3026RAS/MAPK通路Trametinib(GSK1120212)，Pimastertib，Refametinib,TAK733……PI3K/PTEN/AKTBEZ235,XL-765……PD-1/PDL-1Nivolumab,MPDL3280AHSP90…..GanetespibLiTH,etal.JClinOncol2013;31:1039-1049.VariS,etal.ExpertOpinDrugDiscov2013;8(11):1381-1397.多部权威指南强调治疗前的EGFR突变检测ASCO2015指南：考虑用EGFRTKI进行一线治疗的非小细胞肺癌患者应该进行肿瘤EGFR突变检测来确定适合一线使用EGFRTKI还是一线使用化疗药物治疗。ESMO2015指南：•进行个体化治疗决定前应有足够的组织材料进行组织学诊断和分子检测•在疾病进展时应考虑重新检测•应当系统分析EGFR突变状态——在晚期非小细胞肺癌患者组织中进行标准检测A].NCCN2016指南：对晚期非鳞NSCLC及不吸烟/小标本鳞癌的治疗强调了治疗前必须检测EGFR/ALK，并指出“多重/下一代测序项目应该包含这2个靶点的检测”中国原发性肺癌诊疗规范（2016版）在推荐所有NSCLC患者的肿瘤组织都应进行EGFR基因突变检测基础上，补充了如果肿瘤标本不可评估可使用从血液（血浆）标本中获得的ctDNA进行评估.EGFR基因突变和EGFR靶向治疗,50%9%9%5%5%4%3%2%13%EGFREML4-ALKPTEN中国肺腺癌驱动基因突变图谱NSCLC中药物疗效相关的EGFR突变研究RR中位PFSIPASS71.2%vs47.3%9.8vs6.4月First-SIGNAL84.6%vs37.5%8.4vs6.7月WJTOG340562.1%vs32.2%9.6vs6.6月NEJGSG00273.7%vs30.7%10.8vs5.4月OPTIMAL83%vs36%13.1vs4.6月EURTAC58%vs15%9.7vs5.2月LUX-LUNG361%vs22%11.1vs6.9月LUX-LUNG667%vs23%11.0vs5.6月八项随机研究奠定了TKI在EGFR基因突变阳性患者中一线治疗的地位NCCNGuidelinesVersion3.2016Non-SmallCellLungCancerMoketal.,2008;Kimetal.,2008;Hirschetal.,2006突变类型所占比例对EGFR-TKI敏感性19del;L858R~90%敏感G719X;L861Q;S768I~7%亚敏感T790Malone;20ins~3%不敏感EGFR检测样本来源组织活检（肿瘤蜡片）目前检测金标准细胞学标本（恶性胸水）样本品质和肿瘤细胞含量可能比组织样本较低血液标本（ctDNA）-当无法获取组织或细胞学样本的晚期转移患者，作为有效补充DNA片段化/假阴性较多，需要高敏感度技术+++--+--侵入性每个病人都适用动态检测对于组织和胸水都取不到的患者，血液样本是一个很好的补充PirkerRetal.JThoracOncol2010;5:1706–1713;SavicSetal.BrJCancer2008;98:154–160;RekhtmanNetal.JThoracOncol2011;6:451–458;TanakaTetal.CancerSci2007;98:246–252;-++质量控制组织/细胞学检测是目前的金标准60%82%85%27%0%20%40%60%80%100%欧洲日本台湾中国44%41%36%38%46%32%16%6%0%10%20%30%40%50%手术穿刺活检胸水阳性率占比目前国内送检以组织和细胞学标本为主，组织/细胞学检测仍是目前的金标准目前的低送检率源于：1.医生观念2.经济因素3.约20%患者无组织标本FromAZ2015internaldata肉眼判断是否10%肿瘤组织H&E染色&确定肿瘤组织Step1标本病理质控DNA样本制备DNA纯化DNA定量Step2DNA的抽提建立PCR反应体系Step3PCR反应数据的分析Step4报告的解读报告组织检测基本流程组织及细胞学标本的处理-需要临床科室的协助与配合•组织学标本固定要及时，离体后即时处理（15-30分钟内)固定液：10%中性缓冲福尔马林（终浓度4%）；固定液的量一般为组织体积的10-15倍.固定时间：活检标本直接放入固定液，支气管镜活检标本的固定时间为6～24h，手术切除标本的固定时间为12h-48h.•细胞学标本采用95%乙醇固定液，时间不宜少于15min，或采用非妇科液基细胞学固定液，固定时间和方法可按说明书进行操作所有细胞学标本应尽量制作福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixedandparrffin-enbedded,FFPE）细胞学蜡块。将细胞学标本离心沉淀置于包埋盒中，后续操作同组织学标本制作蜡块流程中国原发性肺癌诊疗规范2016版病理评估和质控对于基因检测至关重要-蜡块未染色切片H&E染色切片标记肿瘤细胞比例高的区域刮取标记以内的区域组织处理、蜡块和H&E染色切片制作病理质量控制EGFR基因突变检测无EGFR基因突变检测标本接收质量达标质量不达标为什么EGFR检测要在病理科开展？肿瘤细胞含量评估对于EGFR结果判读影响病理肿瘤细胞含量评估对于EGFR突变结果影响较大，检测流程如果没有该步骤，会造成较多的假阴性。血液检测的价值与优势指导用药*实时监测作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药实现实时动态监测，提高全程管理水平匀质标本循环而匀质的血液标本，在一定程度有效克服异质性*已可以指导EGFR敏感性突变治疗用药1.Molina-VilaMetal.JThoracOncol2008;3:1224–1235;2.SmouseJetal.CancerCytopathol2009;117:67–72;3.VanEjikRetal.PLoSOne2011;6:e177791;4.RekhtmanNetal.JThoracOncol2011;6:451–458吉非替尼获得血液ctDNA伴随诊断适应症欧盟和中国相继批准阿斯利康易瑞沙血液ctDNA伴随诊断非小细胞肺癌患者用药前检测EGFR突变循环血肿瘤细胞(circulatingtumourcell，CTC)即释放到外周血中的肿瘤细胞，目前CTC的捕获比较困难循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)即循环肿瘤DNA，指由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA血液标本的检测对象总量少–500DNA拷贝数/200uL血浆ctDNA丰度低血浆ctDNA的特点片段小–集中在170bp左右，检测方法需要能够耐受In-housedataFractionofEGFRmutantintotalcfDNANumberofEGFRM+plasmasamples61376353activatingmutations,N=32T790M,N=11Newmanetal.,NatMed(2014)Taniguchietal.,ClinCancerRes(2011)信息丢失-能代表全基因组信息？TranslationalOncology.2013NatureVolume.2013IPASS日本亚组血液/组织对比EGFR突变状态研究灵敏性:43%特异性:100%一致性:66%86对血清和组织样本参与比较突变状态组织合计EGFR(+)EGFR(-)血液EGFR（+）22022EGFR（-）293564合计513586EGFR突变型吉非替尼组的PFS显著长于卡铂/紫杉醇组(HR,0.29;95%CI,0.14–0.60;p0.001)EGFR野生型吉非替尼组的PFS与卡铂/紫杉醇组无显著差异(HR,0.88;95%CI,0.61–1.28;p0.50)GotoK.etal.JThoracOncol2012;7(1):115-121一致性敏感性特异性n/N(%)95%CIn/N(%)95%CIn/N(%)95%CIAsiaPac(n=1687)1310/1687(77.7)75.6,79.6343/692(49.6)45.8,53.4967/995(97.2)96.0,98.1Russia(n=894)767/894(85.8)83.3,88.033/109(30.3)21.8,39.8734/785(93.5)91.5,95.1亚太和俄罗斯晚期NSCLC组织/细胞学和配对的血浆样本(IGNITE)中国(N=1355)一致性敏感性特异性PPVNPVn/N(%)95%CIn/N(%)95%CIn/N(%)95%CIn/N(%)95%CIn/N(%)95%CI1051/1355(77.6)75.2,79.8267/548(48.7)44.5,53.0784/807(97.1)95.8,98.2267/290(92.1)88.3,94.9784/1065(73.6)70.9,76.2ChunleiShi,etal.2015ESMOAsia,abstract422PDIFUM吉非替尼治疗EGFR突变的高加索NSCLC652对血液和组织样本参与比较突变状态组织合计EGFR(+)EGFR(-)血液EGFR(+)69170EGFR(-)36546582合计105547652JThoracOncol.2014Sep;9(9):1345-53.一致性:94.3%;敏感性:65.7%;特异性:99.8%AllmutationsMedianPFSmoTumor(n=106)9.7Plasma(n=65)10.2MedianPFSctDNA作为EGFR检测的有效补充020406080100TumorEGFRmutation-positiveTumorEGFRmutation-positivePlasmaEGFRmutation-positiveTumorEGFRmutation-positivePlasmaEGFRmutation-negative69.876.959.5所有突变类型N=74/10650/6522/37TumorEGFRmutation-positiveTumorEGFRmutation-positivePlasmaEGFRmutation-positiveTumorEGFRmutation-positivePlasmaEGFRmutation-negativeObjectiveresponserate(%)IFUM研究：血液检测阳性可以指导TKI用药IFUM(易瑞沙后续评估)研究中，血液与配对组织不同EGFR突变状态患者ORR的一致，19外显子缺失患者PFS也一致(10.3月vs9.6月)69.876.972.582.263.665020406080100所有突变19缺失L858R突变ORR(%)9.710.29.610.39.29.49.69.81010.210.4组织血液所有突变类型PFS(月)组织血液ctDNA检测EGFR突变阳性可用于指导EGFR-TKI治疗Douillard,J.-Y.,etal.(2014).JournalofThoracicOncology9(9):1345.RocheARMS:敏感性:75%,特异性:96%