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产品目录号： Z3100 Z3101 Z3105 SV Total RNA 分离纯化系统简明操作步骤 （离心法） 注意：这是节选操作步骤，详细英文说明书见本简明操作步骤电子版见 目录 1．产品组成和储存条件（第1页） 2．配制试剂 (第2页) 3．表1. 推荐的制备裂解物所用的组织量（第4页） 4．ＲＮＡ的分离纯化步骤 4.A．≦30mg组织样品（第4页） 4.B. ﹥30mg组织样品（第5页） 4.C. 悬浮或贴壁细胞 （第7页） 4.D. 1ml 全血 （第10页） 4.E. 植物组织 （第11页） 4.F. 格兰氏阳性（枯草杆菌）和格兰氏阴性菌（大肠杆菌）（第12页） 4.G.酵母菌(第13页) 5. 缓冲液和溶液的配方（第14页） 6.表2.从组织和细胞中提取RNA的平均产量 1.产品组成和储存条件 产品 包装 目录号 SV总RNA提取试剂盒 250次 Z3105 仅供实验室使用。每个试剂盒包含的试剂，足够进行250次从组织，细胞或血液中提取总RNA的试剂： 5包 收集管（50个/包） 5包 洗脱管（50个/包） 5包 离心柱（50个/包） 250ml RNA裂解液（RLA） 96ml RNA稀释液（RDA）（蓝色液体） 5.5ml β‐巯基乙醇（48.7%） 5瓶 DNA酶I（冻干粉） 2x750ul MnCl2，0.09M 11ml 黄色核心缓冲液 26.5ml DNase 终止液（DSA）（浓缩） 206ml RNA洗涤溶液（RWA）（浓缩） 2X25ml 无核酸酶水 产品 包装 目录号 SV总RNA提取试剂盒 50次 Z3100 仅供实验室使用。每个试剂盒包含的试剂，足够进行50次从组织，细胞和血液中提取总RNA的试剂： 2包 收集管（50个/包） 2包 洗脱管（50个/包） 2包 离心柱（50个/包） 50ml RNA裂解液（RLA） 20ml RNA稀释液（RDA）（蓝色液体） 2ml β‐巯基乙醇（48.7%） 1瓶 DNA酶I（冻干粉） 250ul MnCl2，0.09M 2.5ml 黄色核心缓冲液 5.3ml DNase 终止液（DSA）（浓缩） 58.8ml RNA洗涤溶液（RWA）（浓缩） 13ml 无核酸酶水 产品 包装 目录号 SV总RNA提取试剂盒 10次 Z3101 仅供实验室使用。每个试剂盒包含的试剂，足够进行10次从组织，细胞和血液中提取总RNA的试剂： 2包 收集管（5个/包） 2包 洗脱管（5个/包） 2包 离心柱（5个/包） 10ml RNA裂解液（RLA） 4ml RNA稀释液（RDA）（蓝色液体） 2ml β‐巯基乙醇（48.7%） 1瓶 DNA酶I（冻干粉） 250ul MnCl2，0.09M 2.5ml 黄色核心缓冲液 5.3ml DNase 终止液（DSA）（浓缩） 11.8ml RNA洗涤溶液（RWA）（浓缩） 1.25ml 无核酸酶水 存储条件：将加了β‐巯基乙醇（BME）的RNA裂解液（RLA）存于4oC。每次用后将盖子盖紧。DNase I的溶解见 2，配制试剂部分。将所有其它组分储存在22‐25℃。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司 电话：800 810 8133，010 58256268 网址： 第1页 SV Total RNA 分离纯化系统简明操作步骤（离心法） 不要与Wizard Plus 或者Wizard Plus SV DNA 纯化系统中的组分结合或者替换使用。 注意：RNA稀释液（RDA）以及黄色核心缓冲液分别是蓝色和黄色，易于区分。核心缓冲液的黄色可以让使用者看出在DNA酶处理步骤中，离心柱的膜是否被DNase混合液完全覆盖。染料对于RNA质量以及下游实验没有影响。 警告：硫氰酸胍和β‐巯及乙醇是有毒液体。当用到这些溶液时请戴手套并按标准安全操作进行。当操作来自人、受感染的组织、或者血液这类样品时，按照标准操作处理和丢弃有害物质。 2.配制试剂： 在开始SV 总RNA提取操作之前 ，要准备4种溶液。 注意：在本操作说明中，RNA裂解液（RLA），RNA洗涤溶液（RWA）以及DNA酶终止液（DSA）指本试剂盒中提供的溶液。一旦按照以下方法配制之后，这些溶液分别叫做RNA裂解液，RNA洗涤液以及DNase终止液。 试剂盒Z3105（250次）中四种溶液的配制方法： 溶液 准备步骤 注意事项 DNaseI 按DNase I冻干粉瓶外所示，将一定量的无核酸酶水（试剂盒已提供）加入其中。 轻轻地旋转混合溶液。不要震荡(votex)。我们建议将溶解的DNase分装（如，分成5‐10等份）到无菌无核酸酶的离心管中。每一次RNA提取需要5ul的DNase溶液。将配好的DNase I 存放到‐20℃。不要震荡混合DNaseI溶液不要冻融DNaseI溶液超过三次。 RNA裂解液 将5ml的BME加入到250ml的RNA裂解液（RLA）中。 加入ＢＭＥ后，即在瓶身上标注BME已加入。将ＲＮＡ裂解液储存在４℃。每次使用后将盖子盖紧。 RNA洗涤液 将350ml95％乙醇加进206ml的浓缩ＲＮＡ洗涤溶液（ＲＷＡ）中。加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在22‐25℃稳定，拧紧瓶盖。 DNase终止液 向26.5ml浓缩的DNase终止液(DSA)中加入40ml95％乙醇。加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在22‐25℃稳定，拧紧瓶盖。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司 电话：800 810 8133，010 58256268 网址： CTM048修改于10/09 第2页 SV Total RNA 分离纯化系统简明操作步骤（离心法） 试剂盒Z3100 (50次) 中四种溶液的配制方法： 溶液 准备步骤 注意事项 DNaseI 按DNase I冻干粉瓶外所示，将一定量的无核酸酶水（试剂盒已提供）加入其中。 轻轻的旋转混合溶液。不要震荡(votex)。我们建议将溶解的DNase分装（如，分成5‐10等份）到无菌无核酸酶的离心管中。每一次RNA提取需要5ul的DNase溶液。将配好的DNase储存到‐20℃。不要震荡混合DNaseI溶液不要冻融DNaseI溶液超过三次。 RNA裂解液 将1ml的BME加入到50ml的RNA裂解液（RLA）中。 加入ＢＭＥ后，即在瓶身上标注BME已加入。将ＲＮＡ裂解缓冲液储存在４℃。每次使用后将盖子盖紧。 RNA洗涤液 将100ml95％乙醇加进58.8ml的浓缩ＲＮＡ洗涤溶液（ＲＷＡ）中。加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在22‐25℃稳定，拧紧瓶盖。 DNase终止液 向5.3ml浓缩的DNase终止液(DSA)中加入8ml95％乙醇。加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在22‐25℃稳定，拧紧瓶盖。 试剂盒Z3101（10次）中四种溶液的配制方法： 溶液 准备步骤 注意事项 DNaseI 按DNaseI冻干粉瓶外所示，将一定量的无核酸酶水（试剂盒已提供）加入其中。 轻轻的旋转混合溶液。不要震荡(votex)。我们建议将溶解的DNase分装（如，分成5‐10等份）到无菌无核酸酶的离心管中。每一次RNA提取需要5ul的DNase溶液。将配好的DNase储存到‐20℃。不要震荡混合DNaseI溶液不要冻融DNaseI溶液超过三次。 RNA裂解液 将200ul的BME加入到10ml的RNA裂解液（RLA）中。 加入ＢＭＥ后，即在瓶身上标注BME已加入。将ＲＮＡ裂解缓冲液储存在４℃。每次使用后将盖子盖紧。 RNA洗涤液 将20ml95％乙醇加进11.8ml的浓缩ＲＮＡ洗涤溶液（ＲＷＡ）中。加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在22‐25℃稳定，拧紧瓶盖。 DNase终止液 向5.3ml浓缩的DNase终止液(DSA)中加入8ml95％乙醇。加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在22‐25℃稳定，拧紧瓶盖。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司 电话：800 810 8133，010 58256268 网址： 第3页 SV Total RNA 分离纯化系统简明操作步骤（离心法） 3.表1. 推荐的制备裂解物所用的组织量 样品材料 30g小鼠的器官大约湿重 每175ul 裂解液可用昀大组织量每ml裂解液可用昀大组织量1 肝脏 940mg 30mg 171mg 肾脏 210mg 20mg 114mg 肌肉2 ‐ 30mg 171mg 胰脏 90mg 15mg 85mg 心脏 150mg 60mg 342mg 脑 463mg 60mg 342mg 肺 200mg 60mg 342mg 1.可被一次有效处理的裂解物昀大量是每个离心柱175ul。如果裂解物含有的RNA超过离心柱的容量，在洗涤步骤中有些RNA会丢失。注意对于某些器官和组织，处理整个器官（如，小鼠心脏和肺）所需的裂解液小于1ml。请按建议比例（如154mg小鼠心脏，使用大约450ul RNA裂解缓冲液进行匀浆）并调节粘度。 2.没有给出各种肌肉的大约重量。 4．ＲＮＡ的分离纯化步骤 4.Ａ．从少量组织样品(≦30mg)中分离纯化ＲＮＡ 请使用者准备下列材料：z小型组织匀浆器（如，Brinkmann, tissuemizer® 或Omini Micro homogenizer） z95% 乙醇，无RNA酶 z小离心机 z水浴或者加热块，预热到70℃ 操作步骤： 要用这个系统得到昀好的结果，请使用新鲜组织，储存的组织得到的总RNA产量较低。如果必要，请在液氮中收集样品，并立刻冻在－70℃将来再用。在RNA裂解缓冲液中匀浆的样品可以存在‐20℃或‐70℃。如果样品珍贵，建议每份样品都在‐70℃保存一份，以备当RNA纯化过程中样品损失时用。由于RNA纯化试剂有毒性，而且RNA酶无处不在，在裂解和纯化的整个过程中都要带手套。1.在一个无菌小离心管中加入175ul的RNA Lysis Buffer(加了BME的)，要用无RNA 酶的枪头，带着手套操作。 2.称量上述装有RNA Lysis Buffer的离心管，记录重量。 3.用一个无菌刀片迅速将组织切成小块，冻在研钵里的液氮中，用研棒研磨，然后将液氮和磨碎的组织转移到一个合适大小的无菌离心管中，等液氮挥发后，立即把组织转进装有175ul RNA Lysis Buffer的离心管中，颠倒几次，彻底混匀。 4.称量装有组织和RNA Lysis Buffer的离心管，将第2步的重量从新重量中减去，就得到组织量的值。一般，组织