利用EBV转化人类外周血B淋巴细胞获得永生化细胞株

利用EBV转化人类外周血B淋巴细胞获得永生化细胞株保存人类全基因组摘要：人类外周血B淋巴细胞可以被Ebv在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的LCL。保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化。环孢霉素A法是建立珍贵样本的LCL的首选方法。采血12到36小时分离转化B淋巴细胞，转化液中添加cysA、pha，控制转化时细胞数量在106/ml数量级有助于提高建株率。37℃5%二氧化碳恒温培养，及时添加新鲜的RPMI1648培养液以及全程无菌操作防止细菌真菌污染至关重要。慢冻迅速升温是冻存、复苏的关键。原代和继代之间G条带分析、核型对比、对常见变异位点应用PCR进行质控有助于发现LCL的细胞变异。关键词：EBV转化B淋巴细胞LCL人类外周血B淋巴细胞可以被EB病毒（Epstin-BarrVirus,EBV）在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的人类淋巴母细胞系（lymphoblastoidcelllines,LCL）。该细胞株保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化]2,1[。因此，利用EBV建立具有人类全基因组的永生化细胞株，成为保全全世界各民族特有种群基因及研究人类缺陷基因疾病乃至人类长寿基因探讨的首选方法。近十年来，我国使用这种方法建成了十多个少数民族]6543[、、、以及基因缺陷疾病]13121110987[、、、、、、、免疫抗体技术]1514[、甚至长寿人群家系]16[的LCL，其应范围也已经突破医学延伸至体育领域]17[。事实证明，建立能永久保存的细胞系是打破传统研究中研究的接力式进行与样本的暂时性存在矛盾的关键所在]16[。1EBV转化人类外周血B淋巴细胞建立LCL的机制及病毒来源EBV转化人类外周血B淋巴细胞的机制尚未完全明晰，可能与p53抑癌基因依赖的正常细胞调控机制被抑制以及端粒酶活性增强有关]18[。p53是通过阻滞正常细胞由G1/G0期进入S期来诱导细胞凋亡的。尽管EBV转化的LCL细胞内p53水平增高，但由其介导的细胞凋亡事件能被EBV本身的潜伏蛋白和EBV诱导的细胞蛋白所中断，从而使LCL获得了无限增值的能力。同时，EBV转化的LCL端粒酶活性显著提高，维持了正常人体细胞端粒的长度，使LCL逃逸了细胞的M1、M2期获得了永生化。由EBV转化获得LCL的过程是一种可逆转的现象，这就相当于赋予了LCL永生化特性的同时又没有赋予其复杂的肿瘤背景，从而令LCL成为深入研究细胞永生化机制的良好模型。EBV是一种已知序列的病毒，其插入人类基因中时主要以完整插入为主，这种特性可以被我们加以利用，方便在以后的研究中剔除相关影响。EBV可以利用细胞培养的方法大量获得。市售的B95-8细胞具有永生化特征，使用RPMI1640培养基、37℃、5%CO2条件即可在体外大量增殖。B95-8细胞经饥饿裂解之后，通过离心、过滤后获得的培养上清液富含EBV，具有可使人类外周血B淋巴细胞转化为永生化细胞的能力，该上清液还可以分装、冻存，方便实验员使用。我国现有的EBV主要有三个来源，即上海生物制品所（上生所）、昆明动物研究所（昆明动物所）和中科院人类发育与遗传研究所（中科院遗传所）。笔者曾于2001至2003年间使用中科院遗传所馈赠的EBV，运用EBV转化加环孢霉素A的方法建立涵盖百岁老人至其66岁以下直系亲属共65株永生化细胞株，并在随后的几年间陆续建立起累计超过140株永生化细胞株且全部经冻存、复苏验证成活。2使用EBV转化人类外周血B淋巴细胞建立LCL细胞株的方法使用EBV转化人类外周血B淋巴细胞建立LCL细胞株的过程大致分为五个步骤，即分离B淋巴细胞、EBV转化、LCL细胞培养、LCL细胞验证冻存和LCL细胞复苏培养及再冻存。当前比较成熟的利用EBV转化人外周血B淋巴细胞建立永生化细胞株的方法有三种。分别是环孢霉素A法、微量全血法及冻存全血法。环孢霉素A法通常在培养液中加入终浓度为2ug/ml的环孢霉素A（CysA）及终浓度为0.5%的植物血球凝集素（pha），且需要分离B淋巴细胞并将其细胞数量调整到106个/ml级别才能转化，虽然操作较复杂，但一次性建株成功率高。微量血细胞法不必分离B淋巴细胞，不添加CysA及pha，直接使用0.1ml抗凝全血进行转化。冻存血法的实质是微量全血法，仅仅是在转化前处理样本时将抗凝全血与适量的抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）混匀分装成小支冻存，以便在首次转化失败后的两年内能再次复苏样本进行多次转化以达到提高建株成功率之目的。有文献报道，微量全血法和冻存全血法建立LCL的成功率分别为46%及85%]19[。笔者采用环孢霉素A法三次建立LCL时成功率分别为66.6%(24/36)、96.4%(53/55)和64.7%(66/102)，与相关文献的建株成功率相符]2120[、。建议：对于珍贵不可第二次获得的样本的处理首选环孢霉素A法；微量全血法主要应用在大样本来源时；对于采血数量比较丰富的样本可酌情使用冻存全血法。笔者在转化LCL过程中使用的各种试剂配方如下：RPMI1640基础培养基的配制：在灭菌烧杯中加入大约1500ml灭菌三蒸水，随后分别加入RPMI1640一袋，100U/L青霉素和100U/L链霉素，4gNaHCO3、10ml0.5%的pha[植物血球凝集素]、32ml1MHepes液、24ml0.2M谷安酰胺溶液。充分溶解后，移至灭菌过的2000ml容量瓶，期间使用100ml左右三蒸水洗涤两次烧杯并将洗涤液一并加到容量瓶中。最后用灭菌三蒸水定溶至2000ml。20%胎牛血清培养基：（100ml）使用20ml胎牛血清及80mlRPMI1640基础培养基混匀即可。冻存液：（100ml）使用5ml二甲基亚枫(dimethylsufoxide)及95ml20%胎牛血清培养基混匀即可。随配随用。2~8℃冰箱保存。使用时应尽量将温度控制在8℃以下。3讨论1全血使用肝素抗凝，应用液浓度5u/ml，可抗凝5-10ml外周血。采血之后宜在12到36小时转化。太早，血液中的免疫因子活性太高，可能导致转染率下降。太迟，B淋巴细胞活性可能受到影响，导致细胞凋亡增多、转染率下降。2淋巴细胞分离液应避光4度保存，用前在37度水浴中保温。整个分离过程中，温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量。3分离B淋巴细胞时，先取3ml肝素抗凝全血与3mlRPMI1640培养基等量混匀再沿离心管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液，分离时离心机的转速控制在2500~3500转/分钟之间，时间为10分钟。而在洗涤分离出来的B淋巴细胞时，离心机转速应降低至1500转/分钟，时间延长为15分钟，既保证B淋巴细胞充分集中在离心管底部又不至于因离心力过大导致破碎。洗涤两次即可。4EBV液储存于零下80度。使用时从深低温冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um的滤膜过滤，融化后的EBV在30到60分钟内用完以防活力失效。5当B淋巴细胞分离不够纯的时候，掺杂的其他细胞也将在培养瓶中存活一段时间，这不仅仅会消耗培养瓶中的养分，甚至会因为掺杂细胞凋亡破碎，导致培养瓶中液体变浑浊，从而影响LCL的生长以及我们的观察；当分离出的B淋巴细胞的数量太少时，转化成功后的细胞浓度太低，同样不利于LCL的增值分裂。因此，将转化瓶中B淋巴细胞维持在1~10×106/ml级别中相当有必有。6环孢霉素A能在细胞周期G0G1期之间选择性抑制分离不清的T淋巴细胞的RNA聚合酶Ⅱ，能有效阻止T淋巴细胞对EBV的免疫应答，防止LCL受T淋巴细胞的攻击]22[，从而大大提高建株成功率，因此适用于珍贵样本的转化。但由于其操作较复杂，不建议一个人一次操作数量大于50个样本。7EBV转化人类外周血B淋巴细胞成功的标志是：细胞变亮、变大、变圆，培养瓶中出现分裂成团的细胞。在转化的前三天，我们也可以观察到上述现象。这是由于转化液中混杂的T淋巴细胞正在增生所致。这种细胞基本会在持续培养两、三周以内凋亡。转化所需时间因对象的不同情况差别较大，通常在接种后4~7天左右可以观察到转化细胞。笔者在转化高龄人群外周血B淋巴细胞时通常需要7~10天才可以观察到细胞变化，最长时曾碰到转化21天后才出现细胞变化的情况。这可能与老年人细胞临近末次分裂周期和/或EBV感染背景不同所致。笔者建议，如果在首次转化后15天还没有观察到细胞变化，可对细胞进行二次转化。如二次转化仍不成功只能启用事先冻存的全血进行补救，或重新采样。8悬浮细胞的培养过程防细菌和真菌的污染。配制培养时可以加入终浓度为100U/L的青霉素和链霉素以防细菌生长。培养箱在使用前应该彻底消毒。每次操作前要对操作间进行紫外线照射。尽量使用生物安全柜操作。胎牛血清的使用必须先灭活，然后随时过滤随时使用。暂存培养基的冰箱也要保持干净、有序。各种操作器械最好使用一次性的无菌器械。严格的无菌操作观念是转化成功后能否完成建株的关键。9培养时采用37℃恒温5%二氧化碳培养箱。培养瓶的瓶盖最好采用带滤纸的有孔培养瓶。如无此瓶，务必稍微拧松瓶盖保持必要的通气。瓶中培养液必须含有Hepes液，以便维持培养瓶中的pH值。10对培养瓶中细胞生长不佳，细胞凋亡严重，培养液混浊，甚至生长细胞团中央出现黑色斑块的细胞应及时采用无菌操作取出培养细胞，重新调整细胞浓度后予在新的细胞瓶中继续培养，以期尽量挽救LCL。11当培养瓶中的培养液变黄时，提示瓶中细胞生长旺盛，养分消耗增多，培养液变酸，此时应及时添加新鲜的RPMI1640；当瓶中细胞呈指数式增长时，应及时将细胞团打散，必要时做分瓶处理，以保持适当的细胞密度；当细胞数量达到冻存要求时，应及时收集指数式生长期的生长活跃细胞进行玻璃化冻存。12培养液采用含有20%胎牛血清的RPMI1640培养基，配制培养基的水质、各种成分的添加必须准确，并经过验证。13植物血球凝集素（pha）是人类血淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在pha作用下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴细胞，进而进行有丝分裂。在培养液中添加pha可以促进LCL的生长，但不能令B淋巴细胞转化为LCL。14冻存和复苏。推荐使用玻璃化冻存方法。将处于细胞培养指数期生长的无污染细胞于1000转/分钟离心收集0.5ml沉淀细胞，轻轻吹打混匀后加入到含有1.5ml冻存液的冻存管，盖盖、封口、标记、打包，放置到1cm厚壁的泡沫盒于-20度冰箱保存2小时，随后转到-70度冰箱过夜，最后投入到液氮罐中。15冻存液在常温下对细胞具有一定的毒性，因此，添加冻存液之后的冻存管必须尽快保存到冰箱中。冻存液中胎牛血清的含量要比平时培养时的浓度要高，以保证冻存期间以及复苏期间的细胞需求。细胞内外冰晶的存在是导致冻存及复苏过程中细胞破裂的主要原因，因此，采用慢冻迅速升温复苏的方法可保证细胞的成活率。笔者在2007年底对2001年至2005年间转化并冻存的所有细胞株都进行了复苏再培养。复苏细胞的成活率达90%以上，成功率达100%。16对于需要长期冻存的细胞株，宜采用液氮、多份保存。每次复苏应与原代细胞比较并进行记录。根据国外文献的报道，永生化细胞株传代250次也未观察到变异。而根据中国协和医科大学李彦涵2008年的硕士论文《EB病毒转化的B淋巴细胞永生细胞株长期传代后的遗传稳定性》，其随机选取的10株LCL在传代培养至30代时对细胞进行染色体二倍性分析，未发现数量和结构上异常的细胞有克隆性的增值，常规染色体G显带结果表明，85%以上的细胞株二倍体核型是正常的。在传至30代后随着细胞传代次数的增加，细胞每传一代所需时间增长，细胞数目减少，细胞的分裂相也同时减少，细胞株表现出生长速度变慢等明显的细胞衰老的迹象。有两株LCL传至50代后生长停滞。两株LCL传代至30至60代以后染色体发生显著异常，呈现出肿瘤化细胞的特征。八株LCL传代到80代后，染色体二倍性、高突变STR位点及端粒酶活性的检测仍在进行中。提醒我们，应在冻存前和复苏后，对LCL原代和继代进行G条带分析、核型对比甚至对常见的变异位点应采取PCR介入质控的方式来进行变异评估。4结束语综上所述，利用EB