绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达

错误!未指定书签。I分子生物学综合实验论文题目:绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石43500）错误!未指定书签。II摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过BamHI和NotI双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E.coLiBL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E.coLiBL-21，在含有1μL/mL的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时，用终浓度为0.8mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。关键词：绿色荧光蛋白GFP基因的克隆荧光蛋白水母CLoningandExpressionofGreenFLuorescentProteinGeneHULi-Dan(ClassthreeGradeeight,CollegeofLifeSciencesdepartment,HubeiNormaluniversity,Huangshi435000)Abstract：Greenfluorescentprotein（GFP）,onekindofbioluminenscentproteins,has错误!未指定书签。IIIbeenfoundexistingintheinternalofCoelenterates,suchasfellyfish,polypandcoralpEGFP-N3andpET-28αwasharvestedbysodiumdodecylsulfate(SDS)alkalineprocessextractionandAgaroseGelElectrophoresis.AftertreatingthetwotargetedplasmidswithBamHIandNotI,therecombinantplasmid,namelypET-28α-pEGFP-N3,canberetrievedbyfurthermoreAgaroseGelElectrophoresis.Takingslightrecombinantplasmidprovesthatrecombinantplasmiddoesexistbydienzymecutting(BamHIandNotI).TherecombinantplasmidleftingwouldbetransportedtoE.coLiBL-21thecompetentcells.E.coLiBL-21containingrecombinantGFPgenewasgrownovernightinLBsolidmediumcontainingkanamycin(Finalconcentration:1μL/mL).Whenabsorbanceat600nmvaluewas0.7,isopropyLβ-D-thiogalactopyranosidewasaddedto0.8mMandtheincubationwascontinuedanaddition3h.Keywords:GreenfluorescentproteinFellyfishGeneticCloningFluorescin目录1.前言：...............................................................................................11.1绿色荧光蛋白（GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP）.....................11.1.1GFP研究背景...............................................11.1.2GFP研究应用...............................................21.2基因的克隆与表达..............................................3错误!未指定书签。IV2.实验试剂及实验仪器：.........................................................................52.1实验试剂与材料：..............................................62.2实验仪器：....................................................73.实验方法............................................................................................73.1质粒提取方法:.................................................73.2琼脂糖凝胶电泳及回收:.........................................93.3酶切及连接：.................................................113.4E.COLIDH5Α或E.COLIBL21感受态制备及转入：..................123.5酶切验证重组质粒：...........................................133.6GFP基因的表达................................................143.6.1活化菌种..................................................143.6.2扩大培养..................................................143.6.3IPTG诱导GFP基因的表达...................................144.结果与分析.......................................................................................144.1质粒提取过程中现象与结果：...................................144.2琼脂糖凝胶电泳...............................................154.3E.COLIDH5Α或E.COLIBL21感受态制备及转入结果：.............164.4酶切验证重组质粒.............................................164.5GFP基因的表达结果：.........................................175.讨论：.............................................................................................185.1提取质粒出现图六的原因是：...................................185.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因：...........................185.3E.COLIDH5Α或E.COLIBL21感受态制备及转入出现图九、十原因:..195.4酶切验证重组质粒出现图十一原因：.............................195.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因：.......................196.参考文献..........................................................................................20错误!未指定书签。1前言：1.1绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）1.1.1GFP研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光[1]。日本科学家下村修1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白,如图一所示。这种蛋白在紫外线光中呈现绿色,这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，但它本身发蓝光,通过对光谱的研究,下村修提出了发光景水母所发的绿光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体,而绿色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的应用,但水母素是荧光酶的一种,它需要有荧光素底物,经过酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下呈现强烈绿色[2]。1987年，道格拉斯•普莱沙（DouglasPrasher）克隆出了GFP的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上，马丁•沙尔菲（MartinChalfie）成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生GFP，这不仅证实了GFP与活体生物的相容性，还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。此后，谢尔盖•路基亚诺夫（SergeyA.Lukyanov）又从一种珊瑚中分离出了与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的颜色。美籍华人钱永健（RogerY.Tsien）系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理，。钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现,为研究蛋白之间的图一：夜晚水母体内GFP显色[4]Figure1ChromogenicGFPinFellyfishatnight[4]错误!未指定书签。2相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界各地实验室使用的GFP,都是经过改造优化了的,而钱永健是这方面的先驱和领先人物[2]。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二.长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成[2]。图二：GFP晶体结构图三:质粒pEGFP-N3[5]Figure2CrystalstructureofGFPFigure3pEGFP-N3[5]2001年1月11日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴,这是世界上首次培育成功转基因灵长类动物.添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这种标志基因。1.1.2GFP研究应用在生物学研究中，科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。错误!未指定书签。3但传统的荧光标记在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导至被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”。因此，在GFP发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构。相反，绿色荧光蛋白对生物体无毒无害,分子量小,方便构建载体