纸色谱与薄层色谱法

纸色谱与薄层色谱法实验十五一.实验目的1.了解用色谱法定性分析及提纯化合物的原理；2.熟悉并掌握薄层色谱及纸色谱的基本操作。二.实验原理(1)色谱法色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(分配)的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质,进行反复的吸附或分配的作用,从而使各组分分离.流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相。根据分离的原理不同,可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等,根据操作条件的不同,又可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等类型。(2)薄层色谱薄层色谱常用TLC表示,按其作用机理可以分为吸附薄层层析,分配薄层层析等,基本原理是当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。•薄层层析的优点：适用于小量样品（几到几十微克）的分离又可用来精制样品，特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。(3)纸色谱•纸色谱主要用于多功能团或高极性化合物的分析和分离．•基本原理是以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置，但由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。作为药品的鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的颜色（或荧光）与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。作为药品的纯度检查时，可取一定量的供试品，经展开后，按各药品项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。•Rf=溶液最高浓度中心至原点中心距离/溶剂前沿至原点中心的距离。纸色谱演示三.实验试剂和仪器•甘氨酸、亮氨酸的水溶液，两种氨基酸各取等体积组成混合液，展开剂为5：4：1的水-正丁醇-冰醋酸（体积比），2%的茚三酮乙醇溶液。大试管一支，滤纸（2*15cm）,喷雾器一支，电吹风一把，毛细管（口径1mm）若干支，直尺一把，铅笔一支•1%偶氮苯的苯溶液，1%苏丹III的苯溶液，1%的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ）的水溶液，硅胶Ｇ，9：1的无水苯-乙酸乙酯。研钵一个，台秤，载玻片（7.5*2.5cm）5片，烘箱一个，广口瓶一个。四．操作步骤（一）、薄层色谱偶氮苯和苏丹III的分离（1）、薄层板制备：将硅胶G和CMC溶液调成均匀的糊状，用滴管涂于洁净的载玻片上，取下涂好薄层板，置水平桌面上于室温下晾干，在110℃烘60分钟。置于干燥箱中留以备用。（2）、点样：距底边1cm处划一横线作为起始线，点样直径不应超过2mm，点间距离约为1.8cm，点样时必须注意勿损伤薄层表面。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大，像降落伞。取三块分别点样试剂为偶氮苯和混合液，混合液和苏丹III，偶氮苯和苏丹III•（3）展开：广口瓶需预先用展开剂（9：1的无水苯-乙酸乙酯）饱和，将点好样品的薄层板放入装有展开剂的广口瓶中，薄层板浸入展开剂的深度为距薄层板底边约0.7cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（距薄层板上端1cm左右），取出薄层板，尽快划一横线，晾干，测出显色点与起始线的距离和溶剂上升的距离，并计算比移值。（二）纸色谱--氨基酸的纸上层析•（1）取两片新华一号滤纸，分别用铅笔在距下端点约1cm处起始线，用直尺从中间折叠，在左右两侧点样距约1.8cm，试剂分别为亮氨酸和混合酸，甘氨酸和混合酸.展开剂为5：4：1的水-正丁醇-冰醋酸（2ml）。展开剂在2/15cm的大试管。•（2）待展开剂上升约7厘米时，取出作终点线后在红外灯下烘干。•（3）干燥后喷上2%的茚三酮乙醇溶液显色。•（4）取一块薄层板分别点样亮氨酸和甘氨酸，用展开剂为5：4：1的水-正丁醇-冰醋酸展开。•（5）测出显色点与起始线的距离和展开剂上升距离，并计算比移值。装置图薄层色谱纸色谱五.注意事项•1.薄层板制备好之后，一定要进行活化，除去水分；•2.点样时要注意样点直径要不超过2mm。点几个样点时间隔应1—1.5㎝。一次点样若不够，可点几次，但要等溶剂挥发后再点下一次，防止量多出现拖尾现象；•3.所用滤纸应质地均匀平整且实验中手不要触及滤纸的表面，以免污染；•4.避免两条滤纸在大试管中碰一起，切勿将样点浸入展开剂中；•5.若溶质展开后较分散,则选取其最高浓度中心；•6.在向滤纸喷洒茚三酮时，要以雾状喷洒，不能有液滴在其表面凝集，更不能有液滴在其表面流动，以免影响展开效果.六.思考题•1.如何利用Rf值来鉴定化合物?•2.在混合物薄层色谱中,如何判定各组分在薄层上的位置?•3.展开剂的高度若超过了点样线,对薄层色谱有何影响?•4.纸上层析属于吸附色谱还是分配色谱?