蛋白质分子设计

蛋白质分子设计授课教师：彭书明[e-mail]2020/4/212分子设计分子设计的提出的背景1927年Heitler－London用量子力学成功讨论氢分子的结构,量子化学迅速发展。计算技术的革命和计算方法的改善,量子化学的应用范围越来越广,其概念和计算方法逐渐应用到了化学动力学、催化、电化、生物、药物等领域,产生了一个个新的学科分支———微观反应动力学、量子催化、量子电化、量子生物和量子药物等,和光谱学结合,更促使化学及其相邻学科朝着推理化、定理化、微观化的方向发展。2020/4/213分子设计的定义20世纪70年代,美国麻省理工学院霍恩贝尔教授提出了分子设计。即从分子、电子水平上,通过数据库等大量实验数据,结合现代量子化学方法,通过计算机图形学技术等设计新的分子。设计的新分子或具有某种特定性能,可以是药物、材料或其他,或是一种概念、一种复合物或具有分子意义的物质(如催化剂等)。2020/4/214蛋白质的分子设计蛋白质分子设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。蛋白质分子设计的目的：蛋白质工程提供指导信息探索蛋白质的折叠机理。2020/4/215蛋白质分子设计的必要性生产应用的需要：虽然经过漫长岁月的进化，自然界已经筛选出了数量众多、种类各异的蛋白质，但天然蛋白质只是在自然条件下才能起到最佳功能，在人造条件下往往就不行，例如工业生产中常见的高温高压条件。因而需要对蛋白质进行改造，使其能够在特定条件下起到特定的功能。2020/4/216计算机模拟基因构建突变蛋白质产品功能分析蛋白质设计循环2020/4/217蛋白质三维结构知识的必要性蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的。目前PDB(ProteinDataBank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时：首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。2020/4/218设计目标及解决办法改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。Hartley等于1986年完成了一个重要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。2020/4/219设计目标解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥增加内氢键数目改善内疏水堆积增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换内离子对的置换专一性的改变增加逆转数(turnovernumber)改变酸碱度蛋白质设计的目标及解决办法P582020/4/2110蛋白质分子设计的分类蛋白质分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（denovoproteindesign）。2020/4/2111小改——少数残基的替换定义：小改是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最为广泛使用的方法。采用的方法：主要通过定点突变技术或盒式替换技术有目的改变几个氨基酸残基，借以研究和改善蛋白质的性质和功能。2020/4/2112小改——两个层次1．已知立体结构基础上所进行的工作，直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计2．借助蛋白质一级结构的序列信息及生物化学性质，在未知立体结构的情形下所进行的分子设计工作本部分只介绍第一种，实际上第一种已经包含第二种，第二种只是在不得已的情况下采取的一种努力。2020/4/2113例一：核糖核酸酶小改——举例结构知识：核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，该天然酶具有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys103）。小改设计：在不失去酶活性的基础上增加它的稳定性，日本大阪大学蛋白质工程研究所的SatoshiNishikawa等人尝试在Tyr（酪氨酸）24和Asn（天冬酰氨）84位引入第三个二硫键。2020/4/2114•分子设计和理论验证：从该酶晶体结构可以看出这两个残基是远离催化位点的，经过分子动力学计算证明在这两个残基之间有可能形成二硫键，并且不会影响催化位点的结构。并且采用分子力学和分子动力学方法从核糖核酸的复合物晶体结构建立起核糖核酸突变体的模型。•将Tyr24和Asn84两个残基侧链（保留Cβ，Cγ）消除，将Cγ转变为Sγ。P3•然后经过1000轮突变部位能量最小化和2000轮整体能量最小化以及分子动力学模型建立突变体的结构模型，结构模型中没有不合理的键长、键角和二面角。从设计的角度看这个突变是合理的。•方案的实施：通过基因技术得到突变体，实验证明突变体在保持天然酶活性的基础上大幅度提高了酶的热稳定性。2020/4/2115例二：T4噬菌体溶菌酶小改——举例结构知识：包含164个氨基酸残基，该酶不存在二硫键，只有Cys54和Cys97两个半胱氨酸。分子设计：Matthews等人经过仔细比较和最小化计算设计引入3对二硫键，6个半胱氨酸除了Cys97外，其它5个半胱氨酸由Ile3、Ile9、Thr21、Thr142和Leu164突变而来。结果：得到了全部单个二硫键（3－97，9－164，21－142）以及2个和3个二硫键的突变体。2020/4/2116T4溶菌酶和6种设计的突变体特性酶氨基酸的位置二硫键的数目相对活性Tm39215497142164(%)(℃)wtαIleIleThrCysCysThrLeu010041.9pwtIleIleThrThrAlaThrLeu010041.9ACysIleThrThrCysThrLeu19646.7BIleCysThrThrAlaThrCys110648.3CIleIleCysThrAlaCysLeu1052.9DCysCysThrThrCysThrCys29557.6EIleCysCysThrAlaCysCys2058.9FCysCysCysThrCysCysCys3065.9wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度2020/4/2117实验证明突变体在氧化状态下均比天然蛋白质更稳定；二硫键的环区越长越稳定；二硫键对蛋白质的稳定作用具有加合性，即3对二硫键的稳定效应相当于3个二硫键各自对蛋白质的稳定作用的综合。2020/4/2118另，Matthews等人还研究了Gly（甘氨酸）和Pro（脯氨酸）对蛋白质稳定性的影响，当除去Gly或引入Pro的突变体的变性温度都有所提高。此外，Matthews等人还研究了螺旋偶极的作用。T4溶菌酶含有11个螺旋，其中有7段在N端有带负电的残基，作者在剩余的4段螺旋中选择了两段螺旋进行N端残基突变，Ser38变为Asp（天冬氨酸）；Asn（天冬酰氨）变为Asp，每一个突变体使得变性温度增加2℃，双突变体使得变性稳定提高4℃。说明稳定螺旋偶极能够增强蛋白质的整体稳定性。例二：T4噬菌体溶菌酶小改——举例2020/4/2119蛋白质分子设计的过程首先建立所研究对象的结构模型，在此基础上进行结构－－功能关系研究，然后提出设计方案；通过实验验证后进一步修正设计。往往需要几次循环才能够达到目的。一般分子设计工作可以按以下5个步骤进行：2020/4/2120分子设计的5个步骤1.建立所研究蛋白质的结构模型，可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。2.找出对所要求的性质有重要影响的位置。同一家族中的蛋白质的序列比对、分析往往是一种有效的途径。需要认真考虑此种性质受哪些因素的影响，然后逐一对各因素进行分析，找出重要位点，这是分子设计工作的关键。2020/4/21213.选择一系列的在（2）中所选出位点上改变残基所得到的突变体，一方面使蛋白质可能具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有结构，使其不做大的变动。尽量在同源结构中此位点已有的氨基酸残基序列中进行选择，同时考虑残基的体积、疏水性等性质的变化所带来的影响。4.预测突变体的结构。5.定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质。能否成功地进行分子设计，除了要求有好的计算机软件和高质量的力场以外，还要求工作者有一个坚实的结构化学和物理化学基础，同时对所研究的问题有一个深入细致的了解。分子设计的5个步骤2020/4/2122中改——分子剪裁定义：是指在蛋白质中替换1个肽段或者1个结构域。蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的。因此可以在不同的蛋白质之间成段地替换结构元件，期望能够转移相应功能。2020/4/2123举例中改——抗体分子改造英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验。抗体分子由2条重链，2条轻链组成，重链有4个结构域，轻链有2个结构域；抗原的识别部分位于由轻、重二链处于分子顶部的个1个结构域，该结构域是一个高度可变区。抗体分子与抗原分子互补的决定子是由可变区的一些环状肽段组成的。2020/4/21242020/4/2125意义中改——分子剪裁Winter等人将小鼠单抗体分子重链的互补决定子用基因操作办法换到人的抗体分子的相应部位上，使得小鼠单抗体分子所具备的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。这个实验具有重大的医学价值。小鼠的单抗比人的单抗容易做，而在医学上使用的是人的单抗。采用分子剪裁法可以先制备小鼠的单抗，然后将互补决定子转移到人的抗体分子上，达到与人的单抗分子同样的效果。2020/4/2126大改——从头设计定义：从头设计（denovo）蛋白质分子是指从氨基酸残基出发，即从一级序列出发，设计制造自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能。从头设计建立的2块基石：只有当我们完全掌握了一级结构决定高级结构的规律;掌握了高级结构与生物功能的相关性，才有可能真正地从头设计。目前尚不能够。但是鉴于已经有几百个蛋白质分子结构获得测定，并且从中已经总结得到许多规律性的经验。因此进行从头设计的尝试是可行的。2020/4/2127蛋白质的全新设计＝建筑房屋小改＝住在房屋里中改＝房屋装饰这两者都不能让我们了解房屋建筑。只有设计和建造一所房屋才能学习更多的东西，因此，仅仅靠利用已有的蛋白质或者改造某些部位是远远不够的。只有从头设计并制造全新的蛋白质，在不断的尝试和成功——失败的往复中，才能够更加深入、全面地学习蛋白质，了解蛋白质，以便更好地利用蛋白质。建筑房屋——比喻2020/4/2128蛋白质分子的从头设计基本过程：选择氨基酸残基预测结构结构模型基因克隆多肽合成全新蛋白质蛋白质晶体学，谱学2020/4/2129选择氨基酸残基蛋白质分子设计工作的大部分是在计算机上完成的。要设计具有一定功能的蛋白质，首先要设计正确折叠的蛋白质。设计第一步是选择目标，确定所要建造的三级结构。目前研究水平，所选择的目标均是一些残基不多（60－80个残基）、结构简单并且具有对称性的多肽结构。而这类结构在自然界中广泛存在，如四螺旋束、上下β筒结构、希腊β筒结构等。人们对此类结构研究较多，因而有许多经验规律可循。2020/4/2130序列设计选定目标后就要进行序列设计，选择的序列应尽可能地不同于天然结构的序列。设计时，要充分考虑氨基酸残基形成特定二级结构的倾向性。例如设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；