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实验目录实验一尼龙固定化木瓜蛋白酶实验二β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定实验四酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究实验五植物体内可溶性蛋白质含量的测定实验六酵母蔗糖酶的结晶实验七酵母蔗糖酶的化学修饰实验八酶法澄清苹果汁加工工艺优化实验九原果胶酶的提取与活性测定实验十层析柱装填及柱效测定实验十一温度对酶活力的影响－－最适温度的测定实验一尼龙固定化木瓜蛋白酶一、原理通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。固定化酶的特性主要表现在：①稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。(化学式见课件)二、实验材料、仪器和试剂1、材料CHO—(CH2)3—CHO尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm2、仪器(1)恒温水浴锅(2)紫外分光光度计(3)冰箱3、试剂(1)18.6%CaCl2溶液(2)甲醇溶液(3)3.65mol/LHCl溶液(4)0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5(6)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)(7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液(8)0.5mol/LNaCl溶液(9)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)(10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。三、操作步骤1、固定化酶的制备(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。(2)将尼龙布用3.65mol/LHCI溶液在室温下水解45min，用水洗至PH值中性。(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。(4)取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8)反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.5～1mg/mL)在4℃下固定3.5h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL)。(5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用0.5mol/LNaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。2、酶活力测定(1)溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位(U)(以下同)。(2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。四、结果计算固定化酶总活力活力回收=---------------×100%溶液酶总活力固定化酶总活力数相对活力=-----------------------×100%溶液酶总活力数-残留酶活力数五、注意事项(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。实验二β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化采用物理或化学的方法固定化微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。对于固定化细胞，以微生物细胞在固定化后的生长状态可分为：固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞三类。固定化死细胞是在固定化前或固定化后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂、化学试剂等处理，使细胞处于死亡状态；固定化活细胞是在固定化后细胞仍存活但并不增殖；固定化增殖细胞是固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增殖。这三类固定化细胞中最令人感兴趣的是固定化增殖细胞。因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。完整细胞的固定化对于细胞内酶的利用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。当反应需要辅助因子时，固定化细胞的优点更加突出，因为活细胞能再生辅助因子。微生物细胞的固定化方法与固定化酶的方法类似，有吸附法、包埋法和不用载体法。固定化细胞的活力及其它性质与游离细胞有所不同。细胞经固定化后，一般细胞的稳定性增加。固定化细胞的最适反应温度、最适pH值、最大反应速度大多与游离细胞相同；饱和常数与游离细胞相比有的不变，有的变化很大，这可能是由于载体与底物间静电相互作用以及存在扩散效应的缘故。一、实验目的学习细胞固定化的原理，通过用海藻酸钠包埋法固定含β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌，掌握菌体细胞包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。二、实验原理固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。三、实验步骤及方法1、试剂（1）芽孢杆菌细胞：将对数生长期的芽孢杆菌离心(3200r/min，20min)，收集细胞。（2）海藻酸钠溶液：用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，灭菌后备用。（3）2％氯化钙溶液。（4）2mmol／LONPG溶液。（5）0.1mol／LpH7.O磷酸缓冲液。（6）lmol／LNa2C03。2、细胞悬浮液的制备称取产β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌湿菌体3g，加无菌水6mL，搅拌均匀制成悬浮液。3、细胞的固定化（1）取芽孢杆菌菌体悬浮液3mL，悬浮在10mL海藻酸钠溶液中混合均匀。（2）用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴人到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min。（3）滤出凝胶珠用无菌水洗涤，得到固定化细胞，称重。4、酶活力测定（1）细胞悬浮液酶活力测定：将菌体悬浮液3mL稀释10－20倍，取试管2支，每管加入2mmol／L底物邻硝基苯β一半乳糖苷(ONPG)溶液1mL，在65℃恒温水浴中预热5min后，每管分别加入上述菌体悬浮稀释液1.0mL，65℃精确反应15min后。每管加入2mLlmol／LNa2CO3溶液终止反应，3200r/min离心5min，取上清液在分光光度计上比色，读取420nm处的吸光度值。取2支测定管的平均值。空白管以1.0mL0.1mol／LpH7磷酸缓冲液代替菌体悬浮稀释液，其余操作同上。（2）固定化菌体细胞的酶活力测定：精确称取固定化菌体细胞60mg于一试管内，加入1mL0.1mol／LpH7磷酸缓冲液，加入预热的2mmol／L底物ONPG溶液1.0mL，以下操作同菌体悬浮液酶活力的测定。空白管内不加固定化菌体，也不需离心。所测数据填入下表：总量测定平均值（A420）稀释倍数总酶活力菌体悬浮液3mLa固定化菌体细胞mgb5、计算（1）菌体悬浮液总酶活力a(相对值)测定平均值（A420）×3（总量）×稀释倍数a＝-----------------------------------------1.0×15（2）固定化菌体细胞总酶活力b(相对值)测定平均值（A420）×固定化菌体总量（mg）b＝------------------------------------------60（mg）×15（3）酶活力回收＝(b／a)×100％四、结果与讨论（1）固定化细胞内酶活力回收值的高低与哪些因素有关?（2）固定化细胞的活力、底物专一性、反应温度、动力学常数与游离细胞相比有否不同?（3）比较各种细胞固定化方法的优缺点。实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定酶的纯化一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。离子交换层析法(ion-exchangechromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度(或两者同时改变)来实现。与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料干酵母2、仪器(1)高速离心机(2)恒温水浴锅(3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器3、试剂(1)95%乙醇溶液(2)DEAE-SepharoseFastFlow(3)1mol/L醋酸溶液(5)0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH值7.3)(6)0.05mol/LTris-HCl缓冲液(内含1mol/LNaCl溶液)pH值7.3三、操作步骤1、破碎细胞取15g干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约20~30min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15min，留0.5ml上清液为第一组分。2、加热除杂蛋白将上清液倒入三角瓶，将1mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入到50℃的水浴中，保温30min。在温育过程中，注意经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000r/min的转速离心20min，取0.5ml上清液为第二组分。弃去沉淀。3、乙醇沉淀量出上清液的体积，并加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30min)，于冰浴中温和搅拌20min。然后以12000r/min的转速离心25min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6ml0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5min以上)使其完全溶解，以12000r/min的转速离心25min，取出0.5ml上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步骤操作。4、上柱装DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析，用0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡，然后用0.05mol/LTris-HCl缓冲液(内含1mol/LNaCl溶液)pH值7.3进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0~1mol/L)洗脱，层析柱连上线性梯度混合器，混合器分别装30ml0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH值7.3)和30ml含有100mmol/LNaCl的0.08mol/LTris-HCl缓冲液(pH值7.3)，每1min收集1管。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯