蛋白质和氨基酸的测定

第十章蛋白质和氨基酸的测定第一节概述一.蛋白质概况蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸碱平衡、水平衡的维持、遗传信息的传递、物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是是食品的重要组成之一。一个食品的营养高低，主要看蛋白质含量的高低。蛋白质除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。（一）蛋白质组成与分类1.组成Composition蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要组成元素是C、H、O、N、S、P。另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元素组成百分比。元素组成百分比：元素CHONSP百分比50723160-30-3一般来说，蛋白质的平均含氮量为16%，所以在用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮%乘上蛋白质的换算参数K=6.25即为该物质的蛋白质含量。2.按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为以下三类：①完全蛋白质：这是一种质量优良的蛋白质，含有人体必需氨基酸，并且所含种类齐全，数量充足，比例合适，不但能够维持人的生命与健康，而且能促进婴幼儿的生长发育。如奶类中的酪蛋白、大豆蛋白及小麦中的麦谷蛋白等，都是人体所必须的完全蛋白质。②半完全蛋白质：此类蛋白质中，所含必需氨基酸种类比较齐全，但含量低，相互间的比例又不合适。如果在膳食中以它作为唯一的蛋白质来源，可以维持生命，但不能促进机体的生长发育。例如大麦、小麦中的麦胶蛋白。③不完全蛋白质：这类蛋白质中所含必需氨基酸的种类不全，如果在膳食中把它作为唯一的蛋白质来源，既不能促进机体的生长发育，也难以维持生命。例如玉米中的玉米胶蛋白、豌豆中的豆球蛋白，动物结缔组织和肉皮中的胶原蛋白等。3.食品中蛋白质的氨基酸组成上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，按照α-氨基酸侧链R基团的结构可分为：①脂肪族类：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。②羟基类：丝氨酸、苏氨酸③酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸④碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸⑤酰胺类：天冬酰胺、谷氨酰胺⑥含硫类：半胱氨酸、蛋氨酸⑦芳香族类：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸⑧亚氨基酸：脯氨酸在构成构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠从食品摄入，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能。限制氨基酸：是指食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸缺少或数量不足，就会使食物蛋白质合成为机体蛋白质的过程受到限制，亦即限制了此种蛋白质的营养价值，这类氨基酸就称为～。按易缺少数量多少的顺序排列，称为第一限制氨基酸、第二～等等。如大豆第一限制氨基酸为蛋氨酸。大米第一限制氨基酸为lys，第二限制氨基酸为thr.评价某种蛋白质的营养价值包括两个方面：一是各种必需氨基酸含量是否丰富，二是必需氨基酸的构成是否符合一定比例。（二）各种食品中蛋白质的含量及测定意义1.含量由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高，豆类含蛋白质最高。如黄豆蛋白质含量在40%。牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%2.测定意义测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有及其重要的意义。蛋白质是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。如果膳食中蛋白质长期不足，将出现负氮平衡，也就是说每天体内的排出氮大于抗体摄入氮，这样造成消化吸收不良导致腹泻等。但是摄入量过多会引起机体肝、肾病变。二.蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即利用含氮量，肽键等测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分如碳水化合物，脂肪和维生素等干扰成分很多，故蛋白质的测定最常用的方法是凯氏定氮法。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法测定。色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基的软件，通过电脑控制进行自动检测和计算，也可以快速、准确的测出各种氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方法。第二节蛋白质的定量测定关于氮-蛋白质换算系数对于氮含量换算成蛋白质含量的系数，历来采用6.25，这个数值是以蛋白质平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在测定蛋白质时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。对于用各种原料混合制成的食品，采用占总氮量多的原料为换算系数，对于一些组成成分不明确的食品可采用6.25，我们在作实验报告时，一定要注明所用的换算系数。一、凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法,可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。这里只介绍前三种。（一）常量凯氏定氮法1.原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定⑴消化总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4＝（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：2H2SO4+C＝CO2+2SO2+2H2O二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：1加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾（1689℃）之后可以提高至400℃以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4＝K2SO4+H2O↑+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失：（NH4）2SO4NH3↑+（NH4）HSO4△△2（NH4）HSO4NH3↑+SO3+H2O也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。2加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。硫酸铜的作用机理如下：C+2CuSO4Cu2SO4+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2Ｈ2SO42CuSO4+SO2+2H2O△△此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜生成（褐色），溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛等，应用最广泛的是硫酸铜。3加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一般说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添加氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧水较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再加入。仪器：凯氏消化装置。100页要防止爆沸。幻灯片212.蒸馏消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。幻灯片223.吸收与滴定1用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂，国标用亚甲基兰+甲基红）。指示剂紫红色绿色淡紫红（酸）（碱）（酸）2用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。（pH4.8～6.0红黄）吸收滴定操作步骤：准确称取固体样品0.20-2.00g（半固体2～5g，液体样品10～20ml）→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20mlH2SO4→轻轻摇匀后连接消化装置，在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化→至到样液呈蓝绿色透明时再消化30分钟，停止消化，冷却→加200ml水幻灯片18→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K氏烧瓶中加玻璃珠数粒和80ml40%NaOH→摇动凯氏瓶至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再加入100ml蒸馏水，夹紧夹子→加热蒸馏→至氨全部蒸出（馏出液约250ml即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕色物生成，则蒸馏完毕，可停止加热→用0.1MHCl滴定至蓝色变为微红色即为终点。2.蒸馏消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。配制方法1--3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。方法2--溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。下面针对几点来说明影响氨化完全和速度快的因素（1）K氏烧瓶和取样量如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。（2）分解剂AH2SO4和K2SO4的添加量有机物分解需要的H2SO4量应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g样品K2SO4：H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例：K2SO4：H2SO4=10g：20mlB催化剂用作催化剂的有Hg、HgO、Se、CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但效果好，Se与CuSO4效果相似，TiO2的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同，HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏烧瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。（4）氨的蒸馏和