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膜片钳技术泰山医学院脑科研究所2014.31991Nobel基金会的颁奖评语：•膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。细胞电生理学Electrophysiology细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动测量离子、离子通道细胞兴奋生物电信号细胞生理学细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。膜的“流动镶嵌模型”磷脂双层的屏蔽作用离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,kCa等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.Na-K泵[K+]o[K+]i[Na+]o[Na+]i离子的跨膜分布离子通道(ionchannels)离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。特性：通透性（permeation）选择性（selectivity）门控性（gating）研究技术：膜片钳技术和分子克隆技术开放状态openstate失活状态Inactivestate静息状态restingstate激活activation失活inactivation复活recovery一、离子选择性(selectivity)（大小和电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：KNa100倍、兴奋：NaK10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Gating)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。离子通道的特性(CharacteristicofIonChannels)离子通道的功能(FunctionofIonChannels)1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、学习和记忆3.维持细胞正常形态和功能完整性膜离子通道的基因变异及功能障碍与许多疾病有关，某些先天性与后天获得性疾病是离子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子通道病(ionchannelpathies)。•配体门控通道阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体通道蛋白——离子通道乙酰胆碱受体•电压门控通道：钾、钠、钙离子通道通道蛋白——离子通道电压门控钾离子通道•环核苷酸门控通道气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gatedcationchannel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。•机械门控通道一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞•水通道2003年诺贝尔化学奖：PeteAgre、RoderickMacKinnon通道蛋白——离子通道电生理学研究简史：•二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。•1825年，Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有电流存在。•1912年，Bridge确定了AP的“全或无”现象。同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel奖。•1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获1963年Nobel奖。•1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1μm的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。•Voltageclamp（电压钳技术）由Cole和Marmont发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。•1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位；1969年，又证实N－M接触后的Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。•1976年，德国的Neher和Sakmann发明PatchClamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。•1980年，Sigworth、Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了10~100GΩ的高阻封接(gigaseal)，大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。•1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltageclamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞的运动，并提出了“通道”的概念。•1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模型（简称H-H模型），荣获诺贝尔医学/生理学奖。•1976年，Neher和Sakmann建立膜片钳(Patchclamp)技术。•1983年10月，《Single-ChannelRecording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。•1991年，Neher和Sakmann的膜片钳技术荣获诺贝尔医学/生理学奖。HistoryofIonChannelStudy赫克斯利AndrewFieldingHuxley英国英国伦敦大学1917年--1963年诺贝尔生理学/医学奖发现了神经细胞膜的周边和中央部分与兴奋和抑制有关的离子机制艾克尔斯SirJohnCarewEccles澳大利亚澳大利亚国家大学1903年--1997年霍奇金AlanLloydHodgkin英国英国剑桥大学1914年--1998年离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得·阿格雷和罗德里克·麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本PPT的重点，可参考杨宝峰的≪离子通道药理学≫和Hill的≪IonicChannelsOfExcitableMembranes≫..离子通道功能观察的两种技术对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术电压钳(Voltageclamp)技术膜片钳(patchclamp)技术电压钳技术(VoltageClamp)：电压钳技术，是20世纪初由Cole发明，Hodgkin和Huxley完善，其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的Na电导GNa与电化学驱动力（Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa=INa/（Em-ENa).因此可通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na,k,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使Vm≠Vc,Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点：1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在10－30μm之间)进行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常是60～8OMΩ或120～150MΩ（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1μs）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力膜片钳与电压钳的区别膜片钳电压钳相同点都是通过钳制膜电位而记录离子通道电流不同点钳制方法不同高阻封接细胞内插入电极所用电极不同低阻抗电极2-15MΩ高阻抗电极10-100MΩ钳制面积不同小片膜整个或大块细胞膜记录的通道数不同一个或几个所有通道膜片钳技术•膜片钳技术：从一小片(约几平方微米)膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流，从而了解离子运输、信号传递等信息。基本原理•利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳（patchclamp）内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。膜片钳研究离子通道的一种电生理技术，是施加负压将玻璃微电极的尖端(开口直径约1μm)与细胞膜紧密接触，形成高阻抗封接，可以精确记录离子通道微小电流。能制备成细胞贴附、内面朝外和外面朝内三种单通道记录方式，以及另一种记录多通道的全细胞方式。膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。膜片钳放大器的工作模式：(1).电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是诸如通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。是