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第十章DNA诱变第一节随机诱变第二节DNA体外重组第三节寡核苷酸介导的定点诱变第四节嵌套缺失分离自发突变体诱变剂处理活体新的表型基因的鉴定基因及蛋白质功能研究经典突变研究流程体外诱变：对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。可在体外对纯化的目的DNA进行诱变处理，也可以将目的基因克隆到特定的宿主细胞内进行。方法有嵌套缺失、寡核苷酸介导的定点诱变。随机诱变等，分别产生缺失突变、定点突变和随机的点突变。第一节随机诱变体外随机诱变：随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置及其性质是随机的；在目的DNA片段中引入大量的序列多样性，得到的突变体可能是单点突变，也可能是多点突变。成功的关键有二：1、选择合适的突变率；2、有效的定向选择或筛选方法。方法：错误掺入诱变、盒式诱变、增变菌株诱变、化学诱变。一、错误掺入诱变常规PCR过程中，TaqDNA聚合酶吴3’→5’外切酶活性，导致在DNA合成中以一定频率掺入错误的碱基。每循环错配率在0.1～2×10-4之间。20～25cycles后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3，但对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。原因：在普通条件下，具较大定向错配几率即AT对变GC对。易错PCR：在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率和突变倾向性，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。设计出一种致突变PCR法，使错误率达7×10-3，且无倾向性：①Mg2+→7mM，稳定非互补的碱基配对；②Mn2+→0.5mM，降低聚合酶对模板的特异性；③提高dCTT/dTTT到1mM，促进错误掺入；④提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位置继续延伸。易错PCR通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR策略。将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。易错PCR涉及的遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化(asexualevolution)。它虽然可以有效的产生突变，且操作方法简单，但其一般只适用较小的基因片段，且突变碱基中转换高于颠换，应用范围较为有限。二、盒式诱变盒式诱变（cassettemutagenesis）：是一种定点突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代。包括简单的盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。简单的盒式取代诱变是通过限制性内切酶切除特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接，得到取代突变，是一种定点诱变。若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。简单盒式诱变混合寡核苷酸盒式诱变三、增变菌株诱变正常的菌株细胞内，DNA复制酶具有校正功能，DNA发生损伤或突变可被修复系统修复，因此，自发突变频率较低。将细胞内与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，使细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株。四、化学诱变用化学诱变剂处理双链或单链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个突变体库。常用的化学试剂：烷化剂：带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换，取代其它分子的氢原子。如：烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物等亚硝酸：能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质第二节DNA体外重组依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌法，交错延伸重组，随机引发重组技术。可以将大量突变中的有益突变快速的组合，加速产生DNA序列多样性，使定向进化从以往的“突变-选择”模式变为“突变-重组-选择”模式；在DNA体外重组过程中引入大量随机突变。成功关键：灵敏可靠的选择或筛选方法。一、DNA洗牌法DNA洗牌法（DNAShuffling）：体外同源重组技术。将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸酶Ⅰ消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。二、交错延伸重组在DNAShuffling技术基础上进一步改进的体外同源重组技术。基本原理：在一个反应体系中以两个以上相关的DNA片段为模板，进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性和短暂的复性/延伸反应。在每个循环中，延伸的片段在复性时与不同的模板配对。由于模板的改变，所合成的DNA片段中包含了不同模板DNA的信息。这种交错延伸过程继续进行，直到获得全长的基因。交错延伸重组（StEP）三、随机引发重组一种从至少一个模板多核苷酸制备诱变的双链多核苷酸的方法，其中所述诱变的多核苷酸中至少含有一个核苷酸与所述模板多核苷酸相同位置处的核苷酸不同。步骤：ａ）在所述模板多核苷酸存在下用随机序列或确定序列引物来进行酶催化的ＤＮＡ聚合合成，以生成包含多核苷酸短片段和所述模板多核苷酸的ＤＮＡ库；ｂ）将所述ＤＮＡ库变性成单链片段库；ｃ）在退火条件下使所述单链片段退火，以生成退火片段库；ｄ）使所述退火片段库与聚合酶在使得所述双链片段延伸的条件下培育，以生成含有延伸的单链片段的片段库；ｅ）重复步骤ｂ）至ｄ），直至所述片段库含有所述诱变的多核苷酸。物第三节寡核苷酸介导的定点诱变定点诱变：使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失突变的过程。基本流程：1、化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物；2、通过PCR合成含有预定突变的DNA；3、对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有额外的突变发生。DNA定点突变的种类寡聚核苷酸介导替换、插入、删除盒式突变PCR介导一、经典DNA定点诱变Kunkel法或称“U”法背景介绍：dut-dUTP酶缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。ung-UDG酶缺陷，UDG酶[尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基。在dut+的E.coli中dUTPdUMP在dUTP酶缺失体中（dut-）dUTPdUMPdUTP酶dut：dUTPase突变，可导致E.coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。二、PCR介导的定点诱变优势：突变体回收率高；快速简便准确；不足：PCR的忠实性导致产生非预定突变；每套引物和模板需优化条件；标准PCR不能有效扩增大于3kb的DNA片段。策略：大引物PCR诱变、重叠延伸PCR诱变、双向PCR快速定点诱变。1、大引物PCR定点诱变将所使用的引物之一进行定点碱基突变后，作第一轮PCR扩增。将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物来使用，从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基。2、重叠延伸PCR诱变使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮PCR扩增；将扩增产物进行重叠退火延伸，获得带突变碱基的完整序列；使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩增。应用：重叠延伸剪接术（SOE）可用于将两个DNA片段在所期望的位点进行连接。包括两个步骤：设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补。3、双向PCR快速定点诱变将目的基因环化作为模板进行PCR扩增，所设计的一对引物5’所对应的序列在模板中是连续的，并向DNA反方向进行扩增；扩增后的线性产物依靠两侧的平末端连接成环状的双链DNA，也叫反向PCR定点诱变。4、PCR融合的缺失诱变使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列（此两套引物的5'-端序列互补）；利用两套扩增产物5'-端的互补序列进行退火重叠并进行第二轮PCR延伸，获得完整的突变体。第四节嵌套缺失用外切酶（exonucleaseⅢ）或者DNaseⅠ加Mn2+离子，沿此末端逐步消化目的DNA，只要控制消化时间，即可得到一组依次相差若干碱基目的DNA片断。