猪血清IgG的分离纯化与鉴定

组员：陈忠浩、赵静杰、郭献贵、于芳萍发言人：郭献贵血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定2Contents材料与方法结果与讨论总结与感想3一、材料与方法（一）试验材料1、供试材料采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置1-2h，析出血清，于4℃、8000r/min离心10min，除去血球和纤维蛋白原后，取上层血清，-20℃冰箱内保存备用。42、主要试剂试剂名称规格出产厂家三氯醋酸正辛酸氯化钠氢氧化钠盐酸Tris无水乙醇醋酸分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯上海光铧科技有限公司衢州巨化试剂有限公司天津市永大化学试剂开发中心上海三鹰化学试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司杭州瓶窑和顺化工试剂厂浙江中星化工试剂有限公司5试剂名称规格出产厂家考马斯亮蓝甘油巯基乙醇SDS甘氨酸溴酚蓝DEAE52过硫酸铵乙酸钡分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯浙江中星化工试剂有限公司无锡市龙吉化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司上海源聚生物科技有限公司天津市永大化学试剂开发中心浙江中星化工试剂有限公司安徽三星树脂科技有限公司上海三鹰化学试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司63、仪器设备仪器名称型号生产厂家紫外可见分光光度计S52恒达仪器厂电泳仪CS101上海精密科学仪器有限公司低速大容量离心机TDL-5上海安亭科学仪器厂高速万能粉碎机FW100天津市泰斯特仪器有限公司数显恒温水浴锅HH-2常州国华电器有限公司真空干燥箱DZF-6050上海一恒科技有限公司电子精密天平AB-L梅特勒－托利多仪器有限公司全温振荡（空气）培养箱QYC-211上海福玛实验设备有限公司自动液相色谱分离层析仪MC99-3上海沪西分析仪器厂电热恒温鼓风干燥箱OHG-907385-Ⅲ上海新苗医疗器械制造有限公司酸度计DELTA-320梅特勒托利多仪器(上海)有限公司层析拄Φ1.0×30上海沪西分析仪器厂恒温磁力搅拌器90-2上海亚荣生化仪器厂7A猪血清IgG的提取B猪血清IgG的纯化C提取液蛋白含量测定D猪血清IgG分子量测定81、猪血清IgG的提取——正辛酸法准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中，加入60mmol/LpH4.0醋酸缓冲液160mL，用氢氧化钠溶液调pH4.5。以每毫升稀释液加入25µL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃，5000r/min离心30min，弃去沉淀。上清液4℃预冷，以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min，5000r/min离心15min。将沉淀溶于20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为粗提IgG。92、猪血清IgG的纯化将上述IgG粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋，悬于装有0.01mol/L，pH7.4的PBS的大烧杯中，于磁力搅拌器上4℃透析24h，每6h换一次液。（1）透析脱盐10取2g预处理的DEAE-52纤维素、装成1.5×30cm，柱床高25cm层析柱。缓冲液A(25mmol/LTris-HCl，pH8.8，35mmol/LNaCl)平衡。取2mL上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液A平衡，至流出液在280nm波长洗脱曲线变得平直止。以等量缓冲液A和缓冲液C(25mmol/LTris-HCl，pH8.8，500mmol/LNaCl)连续梯度洗脱；控制流速1mL/min。上样15min后分步收集并记录波峰，2mL/管，合并同一波峰收集管。再用PBS溶液透析，并进行分析鉴定。（2）DEAE-52纤维素离子交换层析纯化IgG113、提取液蛋白含量测定——Folin-酚法配制标准牛血清白蛋白进行Folin-酚法实验，用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280。以蛋白质的浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘制标准曲线。各粗IgG样品液定容至100mL，按Folin-酚法操作，通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。124、猪血清IgG分子量测定——SDS-PAGE配制SDS-PAGE凝胶。将透析过的IgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热5min，各取20µL加入凝胶板的样品槽中，进行电泳。取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，20min后用脱色液脱色。脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标样做出标准曲线计算样品IgG分子量。13电泳设备14二、结果与讨论（一）正辛酸提取猪血清IgG试验结果血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。（二）猪血清IgG纯化结果透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。1、IgG的透析结果15保留时间0-1.6h为缓冲液A洗脱第一峰；1.6h开启缓冲液A-C线性梯度洗脱，获得第二峰；图示两色谱峰分离效果较好，分辨率高，无重叠。2、DEAE-52纤维素层析纯化IgG结果用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化，以OD280nm为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图：16图福林－酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线（三）提取液蛋白含量测定结果1、标准曲线17分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白质含量1.45mg/mL，高盐峰样品蛋白质含量为１.74mg/mL。2、样品IgG含量测定18（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：1标准蛋白2猪血清3纯化的IgG样品19IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键，还原成两条单链，再进一步与SDS结合成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物，SDS-PAGE电泳呈现两条较浓的条带。猪血清球蛋白经正辛酸法提取，DEAE纯化后，所得IgG较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。20IgG相对分子质量标准曲线y=-4.3784x+2.1481R2=0.99830.000.501.001.502.002.500.000.100.200.300.400.50相对迁移率lgMW1、标准曲线制作以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMw）为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下标准曲线。212、IgG样品分子量测定结果根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查出其相对分子质量如下：重链约55000，轻链约24000。即猪血清IgG球蛋分子量为16万左右，与文献《蛋白质技术手册》报道结果一致。22四、总结与感想总的来说，本次试验还是成功的，虽然说试验方法在细节上还有很多需要改进的地方，但实验目的已经达到。本次实验课是一次不同于以往的自主性实验课程，需要我们自己查找资料、设计实验方案，更需要我们独立思考、通过团队合作完成实验。23这种以学生为主，老师为辅的实验课程让我们想得更多，学得更多，得到的也更多。在我们开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展提供了有力的基础。24