基因工程笔记

基因工程课程笔记创建于2014.10.31第1页共34页绪论第一节基因工程的诞生第二节基因工程的安全性第三节基因工程的应用第四节基因工程技术的商业化发展一、定义※Geneticengineering：•在体外将核酸分子•插入病毒,质粒或其它载体系统中,构成遗传物质的新组合•再整合到那些本来不含该类物质的宿主中•从而形成一种新的可连续繁殖的有机体＆就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。※Clone:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。二、特征1.跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。2.无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。三、基因工程的主要操作内容（供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件）1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。3.重组体的转化;将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定:挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达:使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。安全性一、基因工程的安全措施（1）实验室的物理安全①P1级实验室一般装备良好的普通微生物实验室。②P2级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。③P3级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜④P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。基因工程课程笔记创建于2014.10.31第2页共34页具有最高安全防护措施（2）实验室的生物安全（分3级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。）EK1：在自然环境中一般都要死亡。EK2：在自然环境中无法存活。EK3；应该是失去了自我迁移的能力。（3）载体的安全应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如pMB9，pBR322等基因工程的应用ppt20页左右第一章基因操作的主要技术原理第一节DNA的提取与纯化第二节DNA的凝胶电泳第三节核酸的分子杂交第四节基因扩增技术---PCR第五节DNA序列分析第六节酵母双杂交系统DNA的提取与纯化DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；强碱中性复性基因工程课程笔记创建于2014.10.31第3页共34页染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。⑤NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性，高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀⑥乙醇用于沉淀DNA，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解⑨酚-氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。提取质粒DNA的步骤溶菌破膜蛋白质和DNA变性中和离心除去沉淀纯化DNA沉淀DNA溶菌：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA溶液II0.2NNaOH，1.0%SDS溶液III3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）影响质粒DNA产量的因素◆菌株的遗传背景，◆质粒自身的拷贝数DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法（DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。蛋白质280）2.琼脂糖凝胶电泳估计（溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。）DNA分子量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。Marker基因工程课程笔记创建于2014.10.31第4页共34页电压的大小胶的浓度外因构象、极性分子大小、带电量、内因：DNA的凝胶电泳原理：1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为移率。2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。电场条件相同分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。琼脂糖凝胶电泳（空隙大小决定其分辨分子大小的能力。）聚丙烯酰胺凝胶电泳优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。辨别一个碱基差迁移速率影响因素核酸的分子杂交DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。探针的标记：原理:基因工程课程笔记创建于2014.10.31第5页共34页Southern杂交：Northernblot：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。Westernblot：Western杂交的总体过程也与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是DNA，这种将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Westernblotting。几种核酸分子杂交比较作用材料目的Southern杂交DNA判断某生物样品中是否含有某一基因。NorthernblotRNA检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达。Westernblot蛋白Western杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。原位杂交：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落（原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA。菌落杂交主要用来从用质粒或Cosmid构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过Southern杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为9cm的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。）基因工程课程笔记创建于2014.10.31第6页共34页复性50oC1min变性94oC1min延伸72oC2min斑点杂交：斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。第四节基因扩增技术---PCR基因扩增指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式扩增基因工程扩增基因组进化扩增基因的程序性扩增环境诱发扩增PCRPCR体系进行前先95oC5min2.PCR技术的原理PCR的过程：（1）第一步变性（denature）94-95oC下5分钟模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。优先的原因是因为引物的浓度高，链短模板TAQ酶PrimedNTPS氯化镁溶液10*bufferdd水物质体系基因工程课程笔记创建于2014.10.31第7页共34页（3）第三步延伸（extend）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（4）第四步变性（denature）94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（5）第五步重复（repeat）反应体系：（注意添加顺序，考虑经济原则）Dd水10*buffer氯化镁dNTPSPRIMETAQ酶模板影响PCR的因素（1）TaqDNA聚合酶①热稳定性②最适温度高③Taq酶的功能缺点：具5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对（合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序）④TaqDNA聚合酶的激活剂：当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。需做正交试验得到结果。（2）引物（primer)①位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。②引物的长度一般引物设计为长15—30bp（按概率与特异性计算得到）③引物的碱基序列：3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5’端另有很多作用④引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列（形成发夹结构）；⑤引物的Tm值：原始按照计算公式计算，现程序设计。套嵌引物（nestedprimers)设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。（3）dNTPs一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。（4）模板（template）①纯度：但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。②模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。PCR技术的扩展PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA（2）基因的体外诱变（3）基因组的比较研究DNA序列分析一、双脱氧链终止法PCR技术荧光实时定量PCR借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。反向PCR扩增两个引物外侧的未知序列把线性DNA模板转变成环形分子。不对称PCR用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。反转录PCR（RT-PCR)把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。NA病毒。基因工程课程笔记创建于2014.10.31第8页共34页基因工程工具酶核酸酶聚合酶连接酶修饰酶拓扑异构酶双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3'位置的-OH缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与DNA合成，以其5'位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的3'位置的-OH结合，但是，由于它自身3'位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5'磷酸基无法与之结合。1.原理（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。（2）脱氧核糖的连接是以3’5’磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。技术要点：（1）制备单链DNA模板（2）特殊的DNA多聚酶（3）制备2’和3’双脱氧的ddNTP。dNTP/ddNTP=100/1（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）带有放射性或荧光标记批注：①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。（高保真）。还有很多测序方法：见ppt。留意自动测序。第二章基因工程的酶学基础一、(II类)限制性内切酶（1）识别位点4—8bp，回文结构（2）内切酶与识别序列的结合模式