3RACE-takara

TaKaRaCode：D3143’-FullRACECoreSetVer.2.0(20RTReactions)目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存2●试剂盒原理2●特异性引物设计的注意事项3●试剂盒特点3●RNA样品制备3●试剂盒使用注意事项4●使用ControlRNA时的实验操作4●使用实验样品RNA时的实验操作6●实验例8●Q&A8●参考文献9●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA3′末端全长的试剂盒。对RNA结构进行分析时，一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再对扩增出的目的DNA片段进行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反应很难得到全长的cDNA片段，然而在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要的。RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）法能有效地解决这一问题。TaKaRa3′-FullRACECoreSetVer.2.0能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的3′末端的全长序列。本试剂盒中含有完成3′-RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNaseH活性，大大增加了反转录性能。结合使用TaKaRaLATaq®（TaKaRaCode：DRR02AM）进行PCR扩增时，其3′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行3′RACE实验，并且对长片段的3′RACE扩增具有明显优势，我们曾经使用本试剂盒成功扩增了8kbp的3′RACEDNA片段。使用TaKaRaLATaq®扩增得到的PCR产物3′端附有一个“A”碱基，其产物可直接克隆于T-Vector中。反转录引物3′RACEAdaptorPrimer含有由TaKaRa独特设计的dT区域，反转录效率高。3′RACEInnerPrimer中含有BamHI酶切位点，为克隆实验提供了方便。制品中的ControlRNA及ControlPrimer可以用于Control实验。●制品内容制品内容1～9为用于3′RACE实验的反转录用试剂，可用于20次反转录反应（约100次3′RACEPCR反应）；10～12为Control实验用试剂，可进行5次Control实验。1.ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）5μl2.RNaseInhibitor（40U/μl）5μl3.5×M-MLVBuffer40μl4.dNTPMixture（10mMeach）20μl5.3′RACEAdaptor（5μM）20μl6.RNaseFreedH2O1ml7.1×cDNADilutionBufferII1ml8.3′RACEOuterPrimer（10μM）200μl9.3′RACEInnerPrimer（10μM）200μl10.ControlHL60TotalRNA（500ng/μl）*5μl11.3′RACEControlOuterPrimer（10μM）*10μl12.3′RACEControlInnerPrimer（10μM）*10μl*用于扩增HumanProhibitin（PHB）基因。【各种引物序列】引物名称引物序列（5′→3′）3′RACEAdaptor含有由TaKaRa独特设计的dT区域及AdaptorPrimer部分3′RACEOuterPrimerTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3′RACEInnerPrimerCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3′RACEControlOuterPrimerGAGTGCAGGACATTGTGGTAGGG3′RACEControlInnerPrimerATCTTTGACTGCCGTTCTCGACC-1-【实验时需要自备的其他试剂】1.扩增目的DNA片段的上游特异性引物。2.PCR用DNA聚合酶。我们推荐使用TaKaRaLATaq®（TaKaRaCode：DRR02AM），也可以根据实验需要选用其他PCR用DNA聚合酶。●保存：-20℃●试剂盒原理进行3′RACE实验时，首先由ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）将Poly(A)+RNA反转录成cDNA，然后再使用TaKaRaLATaq®（TaKaRaCode：DRR02AM），以反转录的cDNA为模板，进行套式PCR反应。3′RACEAdaptorPrimer作为反转录引物用于cDNA合成（具体原理见图1）。图1.3′-FullRACECoreSetVer.2.0的实验原理图1．以TotalRNA为模板，使用3′RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA。2．使用上游外侧特异性引物（GSP1）和3′RACEOuterPrimer进行1stPCR反应。如果1stPCR反应未能得到目的产物，再使用上游内侧特异性引物（GSP2）和3′RACEInnerPrimer进行2ndPCR反应。3．PCR产物可以直接进行DNA测序或TA克隆。如果使用含有BamHI酶切位点的上游内侧特异性引物进行2ndPCR扩增时，可以使用限制酶（BamHI）对PCR产物进行酶切反应，然后克隆至相关的载体中。-2-●特异性引物设计的注意事项1.长度为20～24bases。2.GC含量50％左右，无二级结构等，并且与RACEPrimer不能形成复杂结构。3.应使用引物设计的专用软件进行设计。●试剂盒特点RNA模板适用于所有Poly(A)+RNA。扩增片段大小我们曾经扩增得到8kbp以上的DNA片段。3′-RACE法RT反应时使用3′RACEAdaptor，PCR反应时下游引物分别使用3′RACEOuterPrimer和3′RACEInnerPrimer。样品材料也适用于目的基因丰度较低或者样品量较少的实验材料。●RNA样品制备本试剂盒是将RNA反转录成cDNA，然后再对cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套，使用RNA操作专用实验台，在操作过程中免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。避【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿时应在使用前按下列方法进行处理。（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。【制备方法】使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。推荐使用TaKaRaRNAisoReagent系列产品或其他RNA提取试剂、试剂盒进行RNA的提取。使用Catrimox-14TMRNAIsolationKitVer.2.11（TaKaRaCode：DWA005）可从血液中快速提取高纯度的TotalRNA。使用本试剂盒进行RT-PCR反应时，每次反应所需的最适TotalRNA量约为1μg。-3-●试剂盒使用注意事项以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。1）同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix；其中包括RNaseFreedH2O、Buffer、dNTPMixture等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。2）使用ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）、RNaseInhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡，分取之前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。3）酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。4）为了防止ControlRNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。5）分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。●使用ControlHL60TotalRNA时的实验操作方法1．反转录反应。反应体系及反应条件如下：◆反应体系：ControlHL60TotalRNA（500ng/μl）1μl3′RACEAdaptor（5μM）1μl5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture（10mMeach）1μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μlReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）0.25μlRNaseFreedH2O4.5μlTotalVolume10μl◆反应条件：42℃,60min↓70℃,15min反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃。-4-2．套式PCR反应。PCR反应使用了TaKaRaLATaq®（TaKaRaCode：DRR02AM）。①OuterPCR反应。反应体系及反应条件如下：◆反应体系:上述1的反转录反应液2μl1×cDNADilutionBufferII8μl3′RACEControlOuterPrimer（10μM）2μl3′RACEOuterPrimer（10μM）2μl10×LAPCRBufferII（Mg2+Free）4μlMgCl2（25mM）3μlTaKaRaLATaq®（5U/μl）0.25μldH2O28.75μlTotalVolume50μl◆反应条件：94℃3min94℃30sec55℃30sec20Cycles72℃1min72℃10min②InnerPCR反应。反应体系及反应条件如下：◆反应体系：1stPCR产物1μldNTPMixture（2.5mMeach）8μl10×LAPCRBufferII（Mg2+Free）5μlMgCl2（25mM）5μlTaKaRaLATaq®（5U/μl）0.5μl3′RACEControlInnerPrimer（10μM）2μl3′RACEInnerPrimer（10μM）2μldH2O26.5μlTotalVolume50μl◆反应条件:94℃3min94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1min72℃10min-5-●使用实验样品RNA时的实验操作方法1．反转录反应。反应体系及反应条件如下：◆反应体系:RNA*Xμl*3′RACEAdaptor（5μM）1μl5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture（10mMeach）1μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μlReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）0.25μlRNaseFreedH2O5.5-XμlTotalVolume10μl*一般情况下，TotalRNA的使用量为1μg，Poly(A)+RNA的使用量为50ng。增加模板RNA的使用量有时会使反应性能下降，不建议使用大于1μg的TotalRNA。◆反应条件*:42℃,60min↓70℃,15min反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃。*对于立体结构复杂的基因，可以先将RNA变性后再进行反转录反应。具体操作为：首先将RNA和引物的混合物70℃变性10分钟，冰上急冷，然后再加入反转录反应的其余试剂，进行