流感病毒实验室检测方法的对比分析

流感病毒实验室检测方法的对比分析研究生：樊衡流感病毒概述•正粘病毒科，RNA病毒。•感染对象：人、猪、马以及禽类。•核蛋白抗原性:甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）。•甲流病毒根据H抗原（血凝素）和N抗原（神经氨酸酶）分亚型，H有17个亚型，N有10个亚型，乙型流感病毒分Victoria和Yamagata系。•感染人的流感病毒：H1N1、H3N2，Victoria和Yamagata系。•对乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒剂敏感；对紫外线和热敏感，56℃条件下30分钟可灭活。流感病毒结构模式图流感病毒电镜图杨静,陈涛,祝菲,etal.2017～2018年度中国大陆流行性感冒病例报告情况分析[J].热带病与寄生虫学,2018(2).2014-2018年4个监测年度流感病例时间分布2017-2018全国各地区发病数地区分布全国流感流行分析致病机制1、血凝素结合呼吸道上皮含有唾液酸受体的细胞2、内吞作用进入细胞3、病毒基因组在细胞核内进行转录复制（8h）4、呼吸道黏膜扩散并感染其他细胞5、诱发细胞因子风暴、全身炎症反应、ARDS、休克及多脏器功能衰竭。流行性感冒诊疗方案（2018年版）[J].中国感染控制杂志,2018.潜伏期末到发病的急性期均有传染性。临床症状出现前24-48小时即可排出病毒，排毒量在0.5-1天显著增加，发病后24小时内达到高峰。成人和较大年龄儿童一般持续排毒5天（3-8天），低龄儿童发病时的排毒量与成人相同，但排毒时间更长。婴幼儿长期排毒很常见（1-3周）。研究证实，抗病毒药物需在症状出现后的36～48h内使用获取最大疗效。秦强,徐保平.流行性感冒诊疗方案（2018年版）解读[J].中国临床医生杂志,2018.流感病毒实验室检测的方法（1）血清学检测：血清IgM和IgG抗体。（2）病毒抗原检测（快速诊断试剂检测）：检测核蛋白。免疫酶法、免疫胶体金和免疫荧光法。（3）病毒核酸检测：检测病毒的RNA。RT-PCR法（常规、荧光、套式、多重PCR、PCR-RFLP、RRT-PCR）、实时荧光定量PCR法、依赖核酸序列的扩增法(NASBA)、介导等温扩增法(LAMP)、焦磷酸测序法、基因芯片技术。特异性和敏感性最好，且能区分病毒类型和亚型。（4）病毒分离培养：使用鸡胚或传代细胞培养分离病毒，是流感病毒鉴定的金标准，但灵敏度低、培养时间长、对实验室条件和实验人员的技术要求高。薛文仲,张斌,王中强,etal.流感病毒的检测和分型技术研究进展[J].生物技术通讯,2011,22(4):559-563.流行性感冒诊疗方案（2018年版）[J].中国感染控制杂志,2018.田燕,梁洁,陆志刚.流感病毒不同检测方法的探讨[J].现代预防医学,2013,40(20):130-130.血清学检测•检测患者血清中的抗体水平。•采集急性期、恢复期双份血清，通过血凝抑制实验、补体结合实验、微量中和实验检测抗体滴度，若恢复期抗体滴度比急性期上升4倍或4倍以上，便可诊断为流感。急性期血清需在症状出现后尽快收集，恢复期血清则在2～4周后采集。•用于回顾性诊断研究，监测流感病毒流行趋势的作用。标本鼻咽抽吸物(洗液)、支气管肺泡灌洗液、咳出的痰、后鼻(喉)拭子、鼻咽拭子、口咽拭子等。抽吸物或洗液、灌洗液优于拭子标本，因为拭子、痰标本中含有较少的柱状上皮细胞(流感病毒感染柱状上皮细胞并在其中繁殖)而含有更多的鳞状上皮细胞。拭子标本易于采集，往往在临床上是首选。抗原与核酸检测对比Rebeloh等利用病毒分离、EIA（免疫酶法）、RT-PCR对流感的暴发流行进行诊断并比较，RT-PCT法比EIA法灵敏，并和地区流感暴发流行具有良好的相关性。RebelodeandradeH,ZambonMC.Differentdiagnosticmethodsfordetectionofinfluenzaepidemics.[J].Epidemiology&Infection,2000,124(3):515-522.抗原与核酸检测对比Plakokefalose等用ELISA和RT-PCR对甲型、乙型流感病毒进行诊断，ELISA和RT-PCR的敏感性分别是64％和100％，特异性分别是98％和97％。PlakokefalosE,MarkoulatosP，KtenasE,etal.AcomparativestudyofimmunocaptureELISAandRT-PCRforscreeningclinicalsamplesfromSouthernGreeceforhumaninfluenzavirustypesAandB[J].JournalofMedicalMicrobiology,2000,49(11):1037.抗原与核酸检测对比鼻咽拭子标本或口咽拭子标本检测甲型流感时，用核酸方法检测的阳性率高，且敏感度也高于抗原方法，差异均有统计学意义。不管核酸方法和抗原方法，鼻咽拭子的阳性率高于口咽拭子。可能原因：①在鼻咽部采集的柱状上皮细胞多而鳞状上皮细胞少；②采集标本时拭子触及舌部被唾液中的溶菌酶污染所致；③含藻酸钙的拭子或木柄拭子含有可抑制PCR或使病毒失活的物质。张欣,闫惠平,马胤雪,etal.不同方法检测流行性感冒样病例鼻咽和口咽拭子标本诊断甲型流行性感冒的评价[J].中华传染病杂志,2011,29(3):154-157.PCR检测敏感性高于抗原检测的原因主要原因：PCR法在病毒含量低时经扩增仍能检出其RNA，抗原检测在病毒含量较低（抗原载量低）时达不到阳性检出限。其他原因：与检测技术、标本类型不同或检测方法及试剂不同有关。田燕,梁洁,陆志刚.流感病毒不同检测方法的探讨[J].现代预防医学,2013,40(20):130-130.张欣,闫惠平,马胤雪,etal.不同方法检测流行性感冒样病例鼻咽和口咽拭子标本诊断甲型流行性感冒的评价[J].中华传染病杂志,2011,29(3):154-157.PCR检测敏感性高于抗原检测的原因以病毒培养或RT—PCR法作为金标准检测甲、乙型流感时，快速抗原方法(美国Quidel公司生产)检测鼻咽拭子的敏感度最高(85％)、其次是鼻拭子(78％)、鼻洗液(69％)，特异度均达97％。3种不同的试剂在检测甲型H1N1(2009)流感患者鼻咽拭子时的敏感度也各不相同，以Quidel公司检测的敏感度最高，达53％。AgoritsasK,MackK,BonsuBK,etal.EvaluationoftheQuidelQuickVueTestforDetectionofInfluenzaAandBVirusesinthePediatricEmergencyMedicineSettingbyUseofThreeSpecimenCollectionMethods[J].JournalofClinicalMicrobiology,2006,44(7):2638-2641.VasooS,StevensJ,SinghK.RapidAntigenTestsforDiagnosisofPandemic(Swine)InfluenzaA/H1N1[J].ClinicalInfectiousDiseases,2009,49(7):1090-1093.检测结果判读核酸检测阳性：结合症状确诊流感病毒感染。抗原检测阳性结果：结合症状临床诊断病毒感染。抗原检测阴性结果：不能完全排除流感病毒感染。假阴性：①病毒含量低；②靶表位区氨基酸的微小改变都可能造成单克隆抗体不能检测或检测敏感性下降；③受稀释比例、结果判读时间长短以及主观判断结果等不确定的因素影响。建议核酸检测：抗原阳性但无症状，有症状但抗原阴性。用药后症状消失抗原阳性。陈浩峰,钟礼立,方亦兵,etal.流感病毒抗原消失时间探讨[J].中国当代儿科杂志,2017(5).•谢谢您的关注！