凋亡相关通路及抑制剂

细胞凋亡（Apoptosis）信号通路抑制剂•细胞凋亡也称为程序性细胞死亡（PCD），是由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，属于发育和老化过程中发生的正常现象。凋亡被视为细胞更新，分化和免疫系统功能发挥的重要环节之一，而免疫反应或者疾病或有毒物质引起细胞损伤时发生的凋亡则是一种正当的防卫机制。体内凋亡的异常会引发许多顽固性疾病，如凋亡过度会导致糖尿病，神经退行性疾病，艾滋病等，凋亡过少会诱发恶性肿瘤，自身免疫性疾病，病毒感染等。因此，对凋亡机制的研究具有非常重要的生理意义。•细胞凋亡的发生伴随着凋亡酶caspase的激活，参与凋亡的caspase分为启动酶（caspase-2，caspase-8，caspase-9，caspase-10）和执行酶（caspase-3，caspase-6，caspase-7）。分别位于凋亡信号的上下游。•凋亡主要通过两条途径来实现，一条是外部途径，通过胞外信号激活细胞内caspase；外部途径又称为死亡受体途径，因其是通过特定的死亡配体（如FasL,TNF）与细胞表面的死亡受体(如Fas,TNFR)相互作用而介导的，从而激活胞内的凋亡酶：起始酶caspase8→caspase3；或切割Bcl家族成员Bid蛋白→细胞色素c释放→caspase9→放大caspase3活化。•另一条是内部途径，通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase，活化的caspase降解胞内的重要蛋白从而引起细胞凋亡。内部途径也称为线粒体途径，因其通过线粒体相关的Bcl-2家族调控细胞色素c的释放。胞浆中与Apaf-1，dATP，caspase-9前体反应形成凋亡复合物。caspase9前体经活化后激活caspase3。此途径为脊椎动物最普遍的细胞死亡途径。•（见图1细胞凋亡信号通路）•胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜蛋白,属肿瘤坏死因子受体(NFR)基因超家族。其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的区域,胞质区有一由同源氨基酸残基构成的结构,有蛋白水解功能,称“死亡区域”(deathdomain)。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递而启动凋亡。已知的死亡受体有五种,TNFR-1(又称CD120a或p55),Fas(CD95或Apo1),DR3(死亡受体3,又称Apo3,WSL-1,TRAMP,LARD),DR4和DR5(Apo2,TRAIL-R2,TRICK2,KILLER)。前三种受体相应的配体分别为TNF,FasL(CD95L),Apo3L(DR3L),后两种均为Apo2L(TRAIL)。死亡受体通路•Fas介导凋亡先由不同的胞质蛋白与受体(FasL)的死亡域结合,然后连接蛋白即Fas相关死亡域蛋白FADD直接与Fas死亡域结合,FADD激活ced-3相关蛋白酶即Caspase-8,引发蛋白水解,导致细胞死亡。•TNF与TNFR1结合可诱导受体死亡结构域的聚集,随后,TRADD通过自身的死亡结构域与聚集的TNFR1死亡结构域结合。TRADD可招募TRAF2、RIP和FADD几种信号分子与激活受体结合而形成受体复合物。TRAF2和RIP可以激活NF-kB和JNKPAP-1,FADD则可以激活细胞凋亡机制。在这些蛋白中,只有RIP具有酶活性,但是RIP在NF-kB和JNKPAP-1的激活过程中的作用还不是很清楚。TRAF2和RIP激活NIK,后者进而激活IKK(I-kBkinase)。IKK磷酸化I-kB,导致I-kB降解,使NF-kB进入核内,激活转录凋亡抑制蛋白IAP，IAP出核，抑制Caspase产生的级联反应。线粒体通路•此通路由含BH3结构域的Bc-l2家族成员Bid、Bad、Puma、Noxa等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl-2家族成员与另外的Bc-l2家族成员(Bax亚家族成员Bax,Bak等,主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆)作用,导致后者的寡聚并插入线粒体膜,引起线粒体膜通透性改变,跨膜电位丢失,释放细胞色素C(Cytc)和其他蛋白。Cytc的释放是线粒体凋亡路径的主要步骤,在ATPPdATP存在的情况下,Cytc与凋亡蛋白酶活化因子Apa-f1形成多聚复合体,通过Apa-f1氨基端的Caspase募集结构域(caspaserecruitmentdomain,CARD)募集胞质中的Caspase-9前体,并使其自我剪切活化并启动Caspase级联反应,激活下游的Caspase-3和Caspase-7,完成其相应底物的剪切,引起细胞凋亡。•此外,定位于线粒体上的转录因子p53能与Bak、Bax直接相互作用,这种相互作用解除了Bak与Mc-l1(Bc-l2蛋白家族中的抗凋亡蛋白)的结合,使Bak中的BH3结构域外露,从而处于促凋亡的结构构象此外,这种相互作用还引起Bak、Bax多聚化,这一系列的变化导致线粒体通透性的改变,使各种促凋亡因子释放到细胞质中。内质网通路•内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所,同时也是Ca2+的主要储存库。内质网在维持细胞内钙离子的稳定以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面都发挥关键性作用。内质网在凋亡信号处理过程中发挥重要作用,内质网通路不同于线粒体或死亡受体介导的凋亡通路。Caspase-12位于内质网膜,内质网钙离子平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累都会诱导Caspase-12表达,同时也导致胞质的Caspase-7转移到内质网表面。Caspase-7激活Caspase-12,激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3而引发细胞凋亡。此过程由内质网失常引起,内质网上Bc-l2家族中抑凋亡的蛋白则可以调节网腔中游离Ca2+浓度,使胞质中的Ca2+维持在合适的浓度水平,进而起到抗凋亡的作用。1.Fasligand（Fas配基）抑制剂：Fas配基（又称为FasL或CD95L）是II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）家族成员。Fas配基与FAs（受体）结合从而引发体内凋亡的发生是细胞凋亡外部途径的重要方式之一，此种方式发生的凋亡在免疫系统的调控和癌症的发展进程中发挥着重要作用。Fasligandinhibitor:是HEK293细胞代谢产生的重组蛋白，为融合在人IgG1Fc片段上的人Fas（aa.7-154）胞外域。能够与Fas配基（物种：人，大小鼠）特异性结合，从而抑制Fas配基与Fas蛋白结合而诱导的凋亡活性。2.caspase抑制剂：Caspase（凋亡酶）参与凋亡，坏死和炎症信号转导通路。参与凋亡的caspase主要分为两类，启动酶（caspase-2，caspase-8，caspase-9，caspase-10）和效应酶（caspase-3，caspase-6，caspase-7），前者位于凋亡信号的上游，后者位于凋亡过程的下游，可直接切割细胞内有重要作用的底物蛋白，引起细胞凋亡发生。至今发现的caspases底物超过700种。启动酶如caspase8可以直接被死亡受体如FasR激活，另外也可以发现caspases在胞内作为一些多蛋白复合物的组成部分，如凋亡过程中caspase9被招募聚合形成凋亡复合物，而caspase1和caspase5能够组成炎性小体的一部分。抑制剂名称作用靶点Z-VAD-FMKCaspases,Description：泛caspase家族抑制剂，不可逆结合caspase蛋白酶的催化位点。Q-VD-OPHCaspases,Description：无毒性，高效的泛caspase家族抑制剂，不可逆结合活化的caspases酶从而阻断凋亡，特别设计用于体内实验。其抑制活性比传统的FMK高几倍，对caspases-1,-3,-8,-9,-10,and-12的IC50值范围是25-400nM。Boc-D-FMKCaspases,Description：不可逆抑制caspase蛋白家族活性从而阻断凋亡。Z-DEVD-FMKCaspase3/7,Description：不可逆结合caspase3活性从而阻断凋亡。Z-DEVD-FMK因具有DEVD识别序列，从而也可以抑制其他含DEVD识别序列的caspase酶活性。抑制肿瘤细胞凋亡。Z-IETD-FMKCaspase8,Description：不可逆抑制caspase8（FLICE）及相关caspase酶活性从而阻断凋亡。IETD属于CPP32酶原的特异性识别序列。Z-LEHD-FMKCaspase9/4/5,Description：细胞渗透性，不可逆抑制caspase9及相关caspase酶活性从而阻断凋亡。Z-YVAD-FMKCaspase1,Description：不可逆抑制ICE活性（Ki=0.76nM），YVAD属于ICE/caspase1的特异性识别序列。Z-WEHD-FMKCaspase5,Description：不可逆抑制caspase5活性。3.Bcl-2家族抑制剂：Bcl-2家族属于较大的蛋白家族，所有成员至少包含4个bcl-2同源结构域（BH，分别命名为BH1，BH2，BH3，BH4）之一，BH对凋亡功能的发挥意义重大。依据BH结构域组成的差异，其中有的成员是抗凋亡因子如Bcl-2，Bcl-xl和Mcl1，而有的成员是促凋亡因子如Bax，Bak和Bok，后者又可以细分为只含BH3的促凋亡蛋白（如Bid，Noxa，Puma和Bad）以及同时包含BH1~3的多结构域蛋白（如Bax和Bak）。绝大多数Bcl-2家族成员含有C端跨膜结构域，该结构域能促使蛋白与线粒体外膜或其他胞外膜结合从而发挥各自功能。Bcl-2基因与多种不同肿瘤的发展和治疗抵抗性密切相关。抑制剂名称作用靶点ABT-737Bcl-2/Bcl-xl/Bcl-w，Description：Bcl-2,Bcl-xL,Bcl-w的小分子抑制剂，细胞渗透性，直接结合以上蛋白的‘水解口袋’从而阻止BH3促凋亡蛋白如tBid，Bad，Bim聚集形成复合物。肿瘤细胞产生化疗抵抗性会引起Bcl家族表达量的提高，则抑制Bcl-2/Bcl-xl过表达能非常明显的诱导肿瘤细胞凋亡发生。ABT-263Bcl-2/Bcl-x（L），Description：高效，口服具生物活性，结构类似于ABT-737的小分子抑制剂，抑制Bcl-2，Bcl-xl与促凋亡蛋白的相互作用。/Bcl-wObatoclax(GX15-070)Pan-anti-apoptosisBcl-2family，Description：高效泛Bcl-2家族（抗凋亡蛋白）小分子抑制剂，与含BH3结构域的抗凋亡蛋白结合从而促进Bax，Bak的释放。HA14-1Bcl-2/Bcl-xl/Bcl-w，Description：新开发的细胞渗透性，非多肽的低分子量Bcl-2蛋白抑制剂(IC50~9μM)，结合蛋白表面疏水口袋。肿瘤细胞中破坏Bax/Bcl-2相互作用congenial诱导凋亡。也能与抗凋亡蛋白Bcl-XL和Bcl-w结合。TW-37Bcl-2/Bcl-XL/Mcl-1，Description：Bcl-2家族抑制剂，与Mcl-1也具有非常高的亲和力。4.p53抑制剂：p53是人体中由TP53基因编码的肿瘤抑制蛋白。对多细胞生物而言，p53意义重大，不仅参与调控细胞循环，而且作为肿瘤抑制剂预防肿瘤发生，p53具有许多抗肿瘤机制，在细胞凋亡，衰老，维持基因稳定性，抑制血管生成中都扮演重要角色。P53属于转录因子，其蛋白水平和翻译后修饰状态随细胞应激而发生变化，应激物如DNA损伤，缺氧，纺锤体损伤，热激等等。P53的激活起始于一系列的生理机制包括ATM,ATR,CHk1和MAPKs的磷酸化作用。MDM2是一种与p53结合的泛素连接酶，靶向p53后进入蛋白酶体降解。总而言之，p53的激活常常引起凋亡发生，p53失活加速肿瘤进程，超过50%的癌症都发现有失活的p53突变型。正常细胞受负调节剂mdm2作用p53处于失活状态，一旦受到细胞损伤或其他应激物刺激，各种通路会引起p53和mdm2复合物的解聚。一旦激活后p53会诱导细胞停滞