离心分离原理与应用

离心分离原理与应用•一、离心技术应用与分类•二、离心理论与离心实验中涉及到的几个重要参数•三、离心机使用中应注意的问题•四、差速离心与密度梯度离心•五、超速分析离心简介•六、生物样品的预处理•七、实验操作实例：线粒体提取，叶绿体提取。•一、离心技术应用与分类1.沉淀分离2.生物材料制备离心3.离心分析1.沉淀分离1）.用于澄清溶液；离心沉淀清除杂质；生物样品中通过添加沉淀剂、特定溶剂离心除去特定物质或从沉淀中获得目标物。从培养液中，浓缩提出培养目标物；处理大量样品；大批量工业用途的离心分离。2）.普通实验室用离心机、冷冻离心机、血液离心机、工业专用离心机。2.生物材料制备离心1）.用于生物大分子、有机大分子、亚细胞结构、动植物病毒、细菌等的分离、提取与纯化；得到有生物活性的材料。2）.使用设备的有：高速冷冻离心机、超速离心机。3.离心分析1）.利用大分子及微小颗粒在离心力场中的生物化学、物理、力学特性，通过光学、电子、照相、扫描记录它们在离心力场中的行为特征，得到表征它们理化特性的参数，沉降系数S值、扩散系数D、分子量M、浮力密度；生物粒子结构研究、组分分析等。2）.设备：分析离心机、有分析系统的离心机。二、离心理论与离心实验中涉及到的几个重要参数1.离心分离理论2.离心实验与离心设计中的几个重要参数3.离心实验中转速与离心时间的计算与选择1.离心分离理论1）.物质在离心力场的作用原理2）.颗粒的离心沉降理论（1）.物质在离心力场的作用原理离心技术是根据物质颗粒在离心力场中的行为发展起来的。不同质量、大小、形状的物质颗粒在离心力场中受力的作用,产生运动的速度取决于该颗粒处于所在离心力场（G）中所受离心力作用的大小。可由离心力场转头的角速度ω（以弧度/秒表示）和颗粒距离旋转轴心的辐射距离（R，以厘米表示）来决定即由下述方程表示。转头旋转一周等于2π弧度，转头的角速度（r/min）可表示为：•离心力场为（2）相对离心力加速度（RCF）离心力场一般用相对离心力场以重力加速度常数g(980cm/s2)的倍数来表示，即RCF的单位为g。相对离心力即为上式n代表（r/min）可简化为：RCF=1.119×10-5(rpm)2R（r/min＝rpm）RCF：RCF值一般即为我们离心时所选择使用的离心力的大小，如选用离心力的十万g离心。即表示为100000×g这里×g代表离心力场单位，不可分开。g为重力加速度；（×g）表示重力加速度的倍数。2）颗粒离心沉降理论（1）粘性介质溶液中的沉降作用颗粒沉降行为及其运动速度不但取决于在所提供的离心力场中受到的离心力作用大小，也取决于颗粒密度、半径、形状，以及悬浮介质的粘度、密度等因素的作用。R：用cm来表示)13.........(980*3600422RnRCF)(2grRCF•根据斯托克斯（S.G.Stokes）定律，粘滞液体中的小球在离心力场中受离心力作用产生运动，通过液体介质时受到反向磨擦力，粘滞阻力（即阻力Ff）的反向作用。这个粘滞阻力为：式中：η——流体的粘滞系数r——颗粒球体半径a——不对称系数（如颗粒非球体时短与长径比）c——移动速度由阿基米德原理，介质液体中的颗粒受到浮力Fb的作用等于颗粒排开液体ρ′——介质液体的密度varFcfv6RrFb2'343•颗粒所受离心力Fc则为：•ρ——小球体的密度•小球重为、浮力为当颗粒小球在Fc、Fb、Ff的共同作用下，在介质液体中运动达到平衡以匀速运动时，所受力系也达到平衡，其表达方程为：即当小球为圆球体时RrFc2334gr334gr3340fbcFFFarRrRrFcc634342323Rrrc23)(34v6•（2）沉降速度•设小球直径为d，在离心力场中有•式在重力场单位下，以Stokes定理表示的颗粒的速度。gdc18)(v2Rdc2218)(vRrc22)(92v从式中可见，球形颗粒的沉降速度不但决定于所处离心力场，也决定于颗粒的大小、密度与介质密度以及悬浮介质的粘度。（3）沉降系数如果用S值定义为单位离心力场沉降速度即有)(182dS2.离心实验与离心实验设计中的几个参数1）沉降系数SS值是表征生物颗粒理化特性的参数。它在一定程度上反映了生物颗粒的大小与结构；未命名的有稳定组成结构的生物颗粒常以S值来表示。悬浮于离心力场中介质液体里的颗粒粒子，在离心力与反向的浮力，磨擦粘滞阻力的作用下，达到恒定的匀速运动状态。若忽略粒子受到来自四周无规力及对粒子行为影响微小的其它作用力如重力等的影响，粒子则受三个作用力，即离心力Fc=ω2rm；粒子置换了一部分溶液而产生的浮力Fb=－m0ω2r；磨擦力Ff=－fv。粒子在近三种力的作用下进行匀速运动。则即式中：—粒子运动速度f—磨擦系数m——粒子质量m0——粒子置换液体的质量0fbcFFF0fv022rmrmv以粒子的质量乘以偏微分比容和密度ρ来代替被置换的溶液质量m0。即代入上式偏微分比容:是生物大分子的一个理化参数,与大分子本身的结构有密切关系。其定义为1克大分子溶质溶大量溶剂中发生的溶剂变化。(生物大分子的偏微分比容值基本上在0.6-0.75范围）。0v22frmrmv)1(2frmrdtdrfm2/)1(mm0）代替（V/dtdr沉降系数S定义：单位离心力场之速度即S是反映离心力场行为特性的重要标志。沉降系数S单位量纲为秒。由于我们研究的颗粒很小（μm-nm级），S值一般也很小，以10-13为一个基本单位S。为记念奠基人Svedberg的贡献，S称为Svedberg常数。即1s=10-13秒。S是具有时间因次的量。S值的大小反映了物质颗粒的大小与结构，物理上的意义是单位离心力场的沉降速度。因次是cm/秒/达因/克。)13......(/2rdtdrS2)分析计算基础（1）超速分析离心测定的S值计算沉降系数S值是分析离心要取得的重要的生物大分子颗粒理化特性参数。由前所得rdtdrS2/(a)212121rrttrdrdtS)(1ln12212ttrrS602rpm又可写为12122loglog)2(60303.2ttrrrpmS积分超速分析离心过程中通过专门的光学设备如UV光吸收光路系统，Schliere光路及光干涉光路系统对不同时间下颗粒粒子在离心力场介质中移动的位置进行电光扫描记录或照像记录。对得到的检测记录图经过分析计算就可以得到该粒子的沉降系数S值了。（2）S值校正为了有一个统一的标准便于比较，将任意介质中的S值要统一校正到标准条件下20℃以水中的S值。设一观察条件下的某介质下的沉降系数为Sobs。可表达为或....)1()1(2020obs20TsolvTTsolvTSSTtobsS)1()1(2020水溶剂wT20/20ST：实验温度Sobs表观S值=实验温度下溶剂对水的相对粘度：实验温度T时水的相对粘度：20℃，水为溶剂下的S值TsolvT/.（3）扩散系数D、分子量M与Svedberg公式作用于一克分子溶质上的总离心力F（1）（M：溶质分子量，溶质分子微分比容，介质密度）xMF2)1(溶质分子沉降中受介质的磨擦阻力为分子受离心力与反向磨擦力平衡时dtdxfFfdtdrdtdx//（2）为沉降速度rMdtdrf2)1(（3）（M：溶质分子量，：溶质分子微分比容：当达到稳态作用于溶质分子的净力为零，溶质分子以恒速沉降在单位离心力场中溶质分子的沉降速度为：（4）（4）代入（3）得（5）假定溶质分子在溶液中沉降受溶剂分子阻力与扩散阻力相同，则（6）（D：扩散系数T：绝对温度R：气体常数）（6）代入（5）即Svedberg公式(b)fMS/)1(DRTf)1(DRTSMrdtdrS2/3.离心实验与离心设计中转速与离心时间的计算1）沉淀离心中转速与时间的计算（1）离心力场一般用相对离心力场（RCF）以重力常数g(980cm/秒2)的倍数来表示。因此（1）：指平均半径（cm）•已知所需RCF的g值，则速度•（2）•9803600)in/(422RmrRCFRgmr249803600)in/(R•也可简化为：（3）•r/min=rpm•(2)粘滞介质中的沉降速度与时间计算•一个微小球形颗粒的沉降速度不仅取决于所提供的离心力场，也还取决于颗粒的密度、半径、颗粒的形状，以及悬浮介质的粘度。因此，在一个特殊介质中使一种球形颗粒从液体的弯月面沉降到离心管底所需要的时间（这与沉降速度成反比）可由下式得到。•（4）t：沉降时间η：悬浮介质的粘度(泊)ρ：介质的密度(g/cm3)ρ0:溶剂密度Rmin：旋转中心到液柱弯月面距离Rmax：旋转中心到管底的距离（cm）RmrgRCF25)in/(1011.1)(minmaxln)(29022RRrtRgmr51011.1/in/(3)影响离心沉降的因素如果需分离的粒子为近似球体，不知其S值，已知其平均值径（d:cm），及其密度（ρ），溶剂密度ρ0（克/厘米），与溶剂粘度η（泊）。（η=0.01泊，20℃水）t：分钟一般沉降时间与离心温度、溶液浓度、粘度、粒子的形态等正相关，相对20℃水，离心温度每改变0.40C离心时间需要改变1%，样品粘度比20℃水的粘度大1%，沉降时间就增加1%。沉降时间与颗粒密度成负相关，其密度增加1%，沉降时间减少1%。(4)颗粒形状对离心沉降的影响粒子形状：球形与椭园体沉降时间可按下式，沉降时间对直径比的倍数关系估算。)(/ln18022minmaxdRRt沉降时间2minmax02lnln)(6018RRdt－2）.差速离心中的转速与时间（1）差速离心中常使用角转头，颗粒由斜的管子内侧向外侧沉降，在外侧沿管壁流动，受力作用，界面的移动可表达为。minRb:最大转头半径a:最小离心半径X:颗粒移动界面的位置界面Rmax图3-3任一离心机的加减速曲线不同，与转头、电机、实验操作的重复准确性有关，实际有效时间)4)........((31)()(310关停达关达ttttttt停关关达达停tttttttdtdtdtdt220220)3......(dtS2aextsaex2如分离物的S值为已知（查表或实验测）要把其中所有大小为某s值的物质全部沉降下来。（5）取对数因为（秒）(6)则：或（7）例如：在a=4.4cm，b=8.9cm（转头参数），rpm＝19000，求：某物质全部分离的时间t。分钟tsaeb2tSab2lnabStrpmln436002222)(1ln43600rpmabSt减恒加tttt3131tabSrpm1ln436002减加恒t3131ttt148601)19000(14.49.8ln10200436002132tSS200020（2）生物样品rpm、t的校正生物样品在不同液体介质下，不同温度下需要进行实际实验条件的离心速度和、时间的校正到标准条件。a.对于实验温度条件的S值修正公式：（8）修正到20℃下水的粘度则时间一般相对20℃水，水温度改变0.4℃，离心时间改变1%。管内温度由20℃改为0℃时离心时间要增大50%。粘度有很大变化时离心时间也应校正。粘度改变1%，t也相应改变1%。浓度如增加1%，对球形粒子离心时间要增加5%，非球体或线状分子浓度增加1%，离心时间t要增加5~10%。01002.0)1()9982.01(ln202Sabt01002.0)9982.01(1020SS。水的粘度)01002.0(20),998