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简介•最早发明的色谱法（俄国植物学家分离植物色素）•直到1960年代后期才普及，因为受到材料和相应技术的限制•实现了高速化，HPLC（highperformanceliquidchromatographyorhighpressureLC)•和GC相比–液体流动相选择余地大，可以用以控制和改进分离条件–通常在常温下进行–对象范围大（80%的有机物）•目前运用最广最多的色谱1．高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需1h之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.2．高效液相色谱法与气相色谱法（1）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。HPLC仪器HPLC和经典LCClassicLC：重力洗脱HPLC：高压、高效、高速HPLC仪器组成HPLC——高压输液系统•高压输液泵–主要部件之一，压力：150～350×105Pa。–为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。–应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性•梯度淋洗装置–特别需要用于组分复杂、容量因子宽的样品HPLC——进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：HPLC——分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。HPLC——检测器Detector•理想的HPLC检测器要求–灵敏度高–对所有的溶质都有快速响应–响应对流动相流量和温度变化不敏感–不引起柱外谱带扩展–线性范围宽–使用范围广•至今没有一种检测器能够类似于GC中的TCD和FID，做到以上的这些要求。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。HPLC——检测器DetectorHPLC——UVdetector•紫外（可见）吸收检测器：UVD–应用最广（70%）–需要组分对紫外光（可见光）有吸收–固定波长，可调波长，光电二极管阵列三类•特点：–灵敏度高；线形范围高；–流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；–对流动相的流速和温度变化不敏感；–波长可选，易于操作；–可用于梯度洗脱。HPLC——FluorescenceDetector•荧光检测器（FD）–选择性浓度型–高灵敏度，高选择性–对象•发射荧光的物质•利用荧光试剂修饰的物质–比UVD检测灵敏度高2-3个数量级，达到10-12~10-13g/cm3–可以梯度淋洗–一般用于检测多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等HPLC——示差折光检测器•differentialrefractiveindexdetector•通过连续检测参比池和测量池中溶液的折射率（refractiveindex）的差别来测定浓度的。•通用型检测器•检测的化合物范围广•检测灵敏度在10-7g/cm3•缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗•有反射、偏转和干涉三种类型HPLC——其他检测器•电导检测器–选择性检测器–在离子色谱仪中应用最多–缺点是受温度影响大，而且在pH7时不灵敏•蒸发激光散射检测器–根据不蒸发的溶质微小颗粒对激光的散射来检测–只跟溶质颗粒的大小和数量有关，与溶质的化学组成无光–不能鉴别化学成分HPLC中的固定相和流动相stationaryphaseandmobilephaseStationaryphase固定相•需要承受高压，按承受高压能力分–刚性固体，以SiO2为基质，应用最广泛，可以通过键合扩大应用范围–硬胶，由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成•按孔隙深度分类–表面多孔型：多孔层厚度小，孔浅，相对死体积小，出峰迅速柱效高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时迅速达平衡，适合做常规分析。但最大允许量受限。–全多孔微粒型：由硅胶微粒凝聚而成。由于颗粒很细，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速，适合复杂混合物分离及痕量分析。Mobilephase流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。Mobilephase流动相（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.HPLC的主要类型和原理Basicprincipleandmaintypes主要类型•液固吸附色谱•液液分配色谱•化学键合色谱•尺寸排阻色谱•亲和色谱•离子色谱一、液固吸附色谱（LSAC）•液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。•原理：X+nSad=Xad+nS达平衡时,有其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。nadnadadSXSXK]][[]][[LSAC——固定相吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。LSAC——流动相•一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。•在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。•洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。•表14-6列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0值。在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。二、液液分配色谱（LLPC）在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。分离原理：液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。LLPC——固定相由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。LLPC——流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。正向分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性，用于分离极性化合物。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。反向分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性，用于分离非极性化合物。其流出顺序与正相色谱恰好相反。三、化学键合相色谱法（CBPC）采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子成键,即可得到各种性能的固定相。基团类型有：疏水基团：不同链长的烷烃和苯基等极性基团：醚和醇、氨丙基、氰乙基等离子交换基团：阴离子交换基团的氨基、季铵盐；阳离子交换基团的磺酸基等CBPC——固定相的制备1.硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。2.≡Si－C或Si一N共价键合固定相共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内.CBPC——固定相的制备3.硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相–这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，PH=2～8范围内正常工作，应用较广泛.CBPC——正相键合相色谱法此法是以极性的有机基团，CN、NH2双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙晴.等）为流动相，分离极性化合物。此时，组