胞浆蛋白核蛋白膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)

胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)(Catalog#DBI-1021;DBI-1022;Storekitat4℃)描述:本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C三种具有独特组分的缓冲液。所有试剂采用PIPES缓冲系统。通过实验，可以得到：细胞胞浆蛋白（其中含有含有可溶性的骨架蛋白）；细胞膜蛋白（其中包含细胞质膜蛋白和细胞器膜蛋白）；细胞核蛋白；其最后剩余的沉淀为难溶性的胞质骨架和纤维蛋白。提取方法简单，可靠，快速。获得的各种部分蛋白纯度高，可用于PAGE电泳、WesternBlot、免疫共沉淀、EMSA等后续研究。该试剂盒所得到的蛋白溶液适合用Bradeford法（DBI生物产品：DBI-1045,1046）蛋白定量和BCA方法（DBI生物产品：DBI-1047,1048）进行定量。II试剂盒组分:III.蛋白质抽提步骤:A.注意事项和试剂准备:•打开试剂盒后，于4度保存蛋白抽提液；于-20度保存蛋白酶抑制剂，样品缓冲液（6×）。•使用前,加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为ExtractionBufferMix——A)；加2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂B中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为ExtractionBufferMix——B)；加2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂C中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为ExtractionBufferMix——C)；试剂盒组分DBI-1021DBI-1022包装50次100次颜色蛋白抽提试剂A蛋白抽提试剂A-1蛋白抽提试剂B蛋白抽提试剂C混合型蛋白酶抑制剂(100×)SDS-PAGE样品缓冲液(6×)50ml500ul50ml25ml1支5支100ml1000ul100ml50ml1支10支棕色棕色棕色棕色棕色绿色•在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。•需要自己提供的试剂：90%acetone，PBS抽提所使用的蛋白抽提试剂使用量抽提步骤Ⅰ.准备细胞1.将培养好的细胞用预冷的PBS清洗2-3次。2.选择合适的方法进行悬浮细胞和贴壁细胞的蛋白抽提：如果样品为悬浮细胞；蛋白抽提试剂的使用量依赖于培养细胞的湿重或细胞数量。a)转移悬浮细胞培养液到一个预先称重的离心管中，简单的离心。b)弃去上清培养基，称量其重量，计算出悬浮细胞的重量。c)按照实验II进行下面的实验。如果样品为单层贴壁细胞：蛋白抽提试剂的使用量取决于培养细胞的器皿大小或细胞数量。a)按照实验III进行下面实验。Ⅱ.悬浮细胞蛋白抽提实验步骤1.吸取取5倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。2.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10分钟。使95-100%的细胞胞浆流出细胞。注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3.以480g的离心速度，4度离心10分钟。4.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（标记为上清1）。于-70℃保存该样品。.5.吸取取3倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。6.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30分钟。7.以5000g的离心速度，4度离心10分钟。8.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70℃保存该样品。9.吸取取1.5倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。.漩涡混合器上高速振荡30秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆30秒。10.以6780g的离心速度，4度离心10分钟。11.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70℃保存该样品。Ⅲ.单层贴壁细胞的蛋白抽提对于贴壁细胞，用细胞刮将细胞刮掉，用PBS清洗细胞3次。600g，离心5分钟，收集细胞。下面实验适用于约5×106个细胞。1.吸取取1ml的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。2.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10分钟。使95-100%的细胞胞浆流出细胞。注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3.以480g的离心速度，4度离心10分钟。4.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（标记为上清1）。于-70℃保存该样品。.5.吸取取500ul蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。6.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30分钟。7.以5000g的离心速度，4度离心10分钟。8.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70℃保存该样品。9.吸取250ul蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。.漩涡混合器上高速振荡30秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆30秒。10.以6780g的离心速度，4度离心10分钟。11.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70℃保存该样品。Ⅳ.蛋白浓度测定可使用BCA定量法（DBI-018）和Bradford(DBI-016)进行蛋白浓度测定。具体程序请参照相关说明书。该试剂盒所获的的相关部分蛋白质是进行后续实验的最佳蛋白来源。1.该试剂盒所获的的相关部分蛋白质浓度很高，可以用相关的缓冲液进行稀释使用，因此最大限度的避免了去垢剂的影响。2.该试剂盒中的蛋白抽提试剂可以和各种蛋白酶抑制剂混合使用，而不影响其抽提效果。3.利用该试剂盒所得到的蛋白抽提液以成功用于SDS-PAGE，WB，EMSA，IP等各种实验，蛋白抽提试剂中的去垢剂完全不影响实验。