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质粒提取实验步骤摇菌：（先倒入锥形瓶再消毒）1将配好的LB培养液高温消毒后，放入40C冰箱，冷却；2在酒精灯旁操作，向锥形瓶中加入100mlLB，加入150ul氨苄（看抗性）；3再向锥形瓶中挑入少量菌（液体：60~80ul；固体：绿豆大小）；4放入摇床，摇一夜。LB培养液的配方1）胰化蛋白胨（）10g/L(tryptone)2）酵母提取物5g/L（yeastextract）3）Nacl10g/L4）去离子水（双蒸水）950ml终体积为1000ml5）配好后，需高温消毒（纱布或报纸包）质粒提取：QIAGENplasmidMidikit（25）试剂盒准备2个50mlEP管，提2个质粒一共要6个50mlEP管。使用前注意事项：1）P1在使用前要加入RNAase，终浓度为100ug/ml，P1一直放40C。2）事先溶解P2（天冷时P2会出现沉淀，应放370C水浴溶解）。3）预冷至P1、P3（P2作用为裂解细胞）至40C。4）提质粒前一天消毒50ml，20ml管子及2mlEP管及LB，干燥待用。5）摇菌和保菌都要开酒精灯，尽量保持无菌，用酒精灯擦桌子和瓶口，不能讲话或者戴口罩。步骤：1摇菌100ml过夜（100ml菌分两次离心，锥形瓶中剩余的菌留作保菌用）；2酒精灯旁操作，倒入50ml管子，6000g、15min（离心力/RCF）、40C（配平及记得更换转子/Rootor）,离心完后弃去上清收集细菌；3用3mlP1重悬细菌沉淀物（充分溶解，沉淀可通过枪反复上下吸打混匀）分两管离心，各加3mlP1，后再混合为一管，保证100ml菌液用了3mlP1重悬。4加3mlP2（P2比较粘稠，用之前要晃匀），充分混匀到整个液体都变蓝（上下轻柔颠倒4~6次），室温放置5min（混匀时不可过猛，以免弄断genemicDNA；裂解物是粘性的，溶解时间切勿超过5min，一旦加入P2就应立即将管子盖上，以防酸化）；5加入预冷的P33ml，立即温和的混匀至蓝色消失（上下轻柔颠倒4~6次），放置冰上避光孵育15~20分钟加入P3后，产生蓬松白色物质，沉淀物变得不粘（沉淀物包括genemicDNA、蛋白质、细胞碎片、SDS）；640C、≥20000g、30min离心，将上清液放入另一10ml的EP管（注意移动时不能晃，以免将沉淀转入），直接在离心室加，加完一个扔一个，注意一点沉淀都不能吸进去，吸时用双枪头，黄枪头套在蓝枪头外，减少冲击；7离心同时，用4mlQBT润洗QIAGEN-tip100（平衡膜），弃去脱下上液；8用2×10mlQC洗QIAGEN-tip100两次，弃去滴下的液体（注意滤膜不要干燥，管中液体满了就弃去，液面不要触及TIP下部，如果触及则用双蒸水冲洗），加入离心后并经过萃取的上清液，萃取步骤如下图；20000g、15min、40C离心把离心后的上清液直接加到TIP中过滤（TIP标记）；9待液体差不多滤过时，用5ml的QF洗脱膜上的DNA，用10mlEP管收集洗脱物（最先流出来的3~4滴弃去），收集后混匀，可用摇床10min；10每管用3.5ml的室温异丙醇沉淀DNA，混匀10min，然后40C、≥15000g、离心30min，沉淀在管底的异丙醇沉淀物有玻璃样外观，非常松软，弃去上清时小心；11先加1ml的70%乙醇洗DNA沉淀，移入1.5ml的EP管（把沉淀打散后再移入，能不用2mlEP尽量不用，TIP的架子要回收），15000g离心10分钟，倒去上液，不要触及沉淀，重复洗一次（把沉淀吹打到液体中，轻柔）；12空气中干燥沉淀5~10分钟，待干燥后（无色透明）用合适体积（50ul）的AE溶解沉淀（560C水浴10min，加快溶解），放入40C冰箱过夜；13第二天测浓度（DNA），稀释到1ug/ul，待转染用。提质粒和保菌：1将摇菌过夜后变浑浊（培养基加入抗生素）的锥形瓶取出，分别装到2个50ml的EP管中，离心40C、6000g、5min。把上清液倒掉，放入—800C保存，等待有时间再提。2锥形瓶中剩余的菌液可以保菌，将其转入1.5mlEP，菌：甘油=7：3，上下颠倒混匀后—800C保存（现加700ul菌液，后剪掉蓝枪头的尖端加300ul甘油）。AABB离心后把上清液吸到干净的50ml的EP管，两管变一管，管盖和管壁上都标记。AB加入等体积的氯仿上下颠倒混匀（萃取提纯）