细菌β-内酰胺酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

1细菌β-内酰胺酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌β-内酰胺酶报告基因活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学方法，快速有效地裂解细菌细胞，通过高速离心，获得澄清裂解悬液，在β-内酰胺酶反应体系里，以头孢硝噻吩为黄色底物，水解所产生的红色产物，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法定量测定细菌裂解悬液制备样品中的β-内酰胺酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于活体细菌内源性或外源性β-内酰胺酶活性分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、比色敏感。技术背景β-内酰胺酶（β-lactamase；EC3.5.2.6）属于细菌酶蛋白家属的成员之一，29KD单体蛋白（monomeric）。大量细菌分泌产生，分布在细菌周边和细菌细胞浆内，通过水解酰胺键（amidebond），分解β-内酰胺（β-lactam）的4原子环状结构，由此产生抗菌素抗性，例如青霉素类、头孢菌素类（cephalosporins）、头霉素类（cephamycins）、碳青霉素烯类（Carbapenems）抗性。β-内酰胺酶功能上分成4大组，结构上分成4大类。β-内酰胺酶催化反应敏感有效，且容易测试。因此β-内酰胺酶成为崭新的报告基因，替代传统的β-半乳糖苷酶报告基因系统，可以在活体细胞内实时监测基因转录、检测蛋白间相互作用、评价基因表达载体转染的效果。基于头孢硝噻吩（Nitrocefin），一种黄色底物，对于所有β-内酰胺酶具有敏感性，在β-内酰胺酶的催化下，水解产生红色产物，通过486nm波长的吸光峰值分析，来定量分析β-内酰胺酶的活性。产品内容裂解液（ReagentA）10毫升活性液（ReagentB）250微升缓冲液（ReagentC）20毫升底物液（ReagentD）200微升阴性液（ReagentE）2毫升产品说明书1份保存方式保存在-20℃冰箱里；底物液（ReagentD）避免光照；有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器（微型）台式离心机：用于样品操作比色皿或酶标板：用于比色检测的容器恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育分光光度仪或酶标仪：用于比色分析2实验步骤一、样品准备1．准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM2．移取500微升过夜培养的细菌到15毫升锥形离心管3．加入用户自备的10毫升新鲜培养液和诱导剂4．放进37℃摇床孵育2小时，速度为220RPM（OD600＝0.4至0.8，即1至2X107细胞/毫升）5．置于冰槽里5分钟6．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g7．小心抽去上清液8．加入500微升裂解液（ReagentA），充分混匀9．转移到预冷的1.5毫升离心管10．加入12.5微升活性液（ReagentB）11．强力涡旋震荡15秒12．置于冰槽里15分钟13．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备1．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长486nm，间隔5分钟，读数3次（共10分钟），并置零2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（ReagentD）避免光照3．缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度4．检测实验开始前，移取20微升底物液（ReagentD）到1.5毫升离心管，加入180微升阴性液（ReagentE），混匀，标记为反应工作液，置于暗室里备用。三、背景对照测定1．移取780微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿2．加入100微升反应工作液3．上下倾倒数次，混匀4．在37℃温度下孵育3分钟5．加入20微升阴性液（ReagentE）6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（10分钟读数－0分钟读数）四、样品测定31．移取780微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿2．加入100微升反应工作液3．上下倾倒数次，混匀4．在37℃温度下孵育3分钟5．加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（10分钟读数－0分钟读数）五、计算样品活性[（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.02（样品容量；毫升）X20.5（毫摩尔吸光系数）X10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔头孢硝噻吩/分钟六、酶标板测定1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品2．分别移取195微升缓冲液（ReagentC）到96孔板中的所有孔中3．分别加入25微升反应工作液4．轻轻摇动96孔酶标板5．在37℃温度下孵育3分钟6．分别加入5微升阴性液（ReagentE）或待测样品（50微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）7．轻轻摇动酶标板8．即刻放进酶标仪检测：10分钟读数和0分钟读数9．活性计算[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X20.5（毫摩尔吸光系数）X0.6（光径距离；厘米）X10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔头孢硝噻吩/分钟注意事项1．本产品为20次（比色皿）和80次（酶标板）操作2．操作时，须戴手套3．底物液（ReagentD）避免光照和反复冻融4．用户可以根据需求，配制反应工作液，不宜存放5．如果样品有限酶活性过低，建议使用细菌β-内酰胺酶活性荧光定量检测试剂盒（GMS10093.3）6．反应孵育完成后，即刻进行比色测定7．测定值由低到高变化；测定持续10分钟8．比色测定后，比色皿须清洗彻底9．样本测定10分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性410．建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度12．β-内酰胺酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔的头孢硝噻吩13．本公司提供系列β-内酰胺酶检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感使用承诺秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。友情提醒IFITDOESN’TWORK，RECHECKYOUREXPERIMENTTOSEEWHATYOUDIDWRONG。