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Genistein后处理介导大鼠海马CA1区eNOS/Nrf2/HO-1信号通路及其神经保护作用来源：赛恩斯http：//一、研究的背景及意义1.对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关注的重点。2.缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组织的损伤--即缺血再灌注损伤。3.氧化应激和炎症是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要组成部分。脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生，并迅速启动损伤级联，加剧了初始损害最终导致神经元不可逆的损伤。因此，再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性神经元死亡的关键。4.Genistein具有酪氨酸激酶抑制剂活性和抗氧化作用。5、Genistein作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱导的脑缺血小鼠模型显示Genistein具有抗氧化活性。6.eNOS活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发现，Genistein能够诱导eNOS活性并激活核因子NF-E2相关因子(Nrf2)，进而诱导抗氧化酶表达、减少心血管疾病的发生。那么，Genisteinpostconditioning(GPC，即缺血后给予Genistein)是否能通过eNOS/Nrf2/ARE信号通路降低氧化应激，从而发挥抗缺血性神经元损伤的作用？目前尚未见报道。本研究采用四动脉结扎(4-VO)全脑缺血模型，观察GPC对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论依据。二、材料与方法1.主要实验仪器和试剂•大鼠脑立体定位仪•大鼠脑微量注射泵•冰冻切片机•激光扫描共聚焦显微镜•酶标仪•电泳设备•摇床•Morris水迷宫•超低温冰箱等•组织裂解液•BCA蛋白浓度测定试剂盒•eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相应的二抗•NBT/BCIP显色液•NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及对应的荧光二抗•TUNEL试剂盒2.实验分组SPF级成年雄性SD大鼠随机分组及4-VO模型ShamI/RVeh1(IR+DMSO)GPCVeh2(GPC+NaCl)L-NAME30m24hI10mI10mI10mI10mI10m30m6h1d5d椎动脉电凝并分离颈总动脉缺血尾静脉注射Genistein1mg/kg侧脑室注射L-NAME1mg/5μl0.9%NaCl0.1%DMSO3d7d9d3.技术路线图再灌注5d检测海马CA1区神经元的凋亡及存活实验方法及检测指标再灌注30min,6h,1d,3d观察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表达免疫荧光染色法蛋白免疫印迹技术TUNEL染色及NeuN染色再灌注3d观察海马CA1区神经元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白的表达及定位Morris水迷宫再灌注7-9d，检测大鼠的空间学习和记忆能力4.统计学分析数据整理后，应用SigmaStat3.5统计软件进行统计学分析。所有计量资料数值以均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD)，各实验组之间比较采用q检验(Newman-keulstest)，P0.05为差异有统计学意义。三、实验结果与讨论Genistein后处理是否具有神经保护作用呢？图1NeuN及TUNEL免疫荧光染色观察再灌注5d大鼠海马CA1区神经元的存活及凋亡图A：NeuN(红色)染色：生存的神经元；TUNEL(绿色)染色：凋亡样神经元；图B：海马CA1区1mm长度内NeuN阳性神经元数量统计图；图C：海马CA1区1mm长度内TUNEL阳性神经元数量统计图;*P0.05vs.I/R组，#P0.05vs.GPC组，n=5;40×,bar=50μmNeuNpositivecell050100150200250300*#ShamI/RGPCL-NAMEABTUNELpositivecell050100150200250*#ShamI/RGPCL-NAMEC小结1Genistein后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，eNOS激酶抑制剂L-NAME减弱了该作用，说明eNOS可能参与了此保护作用。Genistein后处理是否诱导eNOS激活（磷酸化）?图2GPC对大鼠海马CA1区神经元eNOS、p-eNOS蛋白表达的影响图A：再灌注不同时间点p-eNOS、eNOS蛋白的表达；Sh：Sham组；R：再灌注；－：I/R组；＋：GPC组；GPC:Genistein后处理；图B：p-eNOS蛋白表达统计图：n=4；*p0.05vs.I/R组AB图3L-NAME对再灌注3d大鼠海马CA1区神经元eNOS磷酸化水平的影响图A：各实验组再灌注3dp-eNOS蛋白表达；图B：各实验组再灌注3dp-eNOS蛋白表达统计图，n=5，*p0.05VS.I/R组；#p0.05VS.Vehicle2组AB小结2Genistein后处理可诱导全脑缺血大鼠海马CA1区eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制剂L-NAME可有效降低GPC诱导的eNOS磷酸化水平。结果揭示：eNOS磷酸化水平升高参与了Genistein的神经保护作用。Genistein后处理是否能有效降低缺血再灌注后神经元的氧化应激损伤呢?4-HNE是脂质过氧化的最终产物，被公认为氧化应激最稳定的标记物8-OHdG，是DNA氧化损伤的特异产物图4全脑缺血再灌注3d，各实验组大鼠海马CA1区4-HNE及8-OHdG免疫荧光染色GPCI/RABGPCI/R图A：绿色:NeuN；红色:4-HNE；图B：红色:DAPI；绿色:8-OHdG；n=4-5；40×；bar=50μm小结3GPC能有效降低氧化应激损伤；eNOS激酶抑制剂L-NAME废除了此神经保护作用。Nrf2/ARE信号是生物体内抗氧化应激反应最重要的内源性防御系统。那么，GPC是否通过eNOS诱导了此信号通路?图5A-CGPC促进大鼠海马CA1区Nrf2蛋白表达图A：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达；图B：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达统计图，n=4，*p0.05vs.I/R组；图C：再灌注3d各实验组Nrf2蛋白的表达及统计图；*p0.001vs.I/R组，#p0.001vs.Vehicle2组ACShFoldchanges0.0.2.4.6.81.01.21.41.61.8I/RGPCR30mR6hR1dR3d***B图5D免疫荧光染色法观察大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内Nrf2的表达及定位绿色：Nrf2；红色:NeuN；黄色：二者的共定位；40×；bar=30μm.L-NAME图6大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内HO-1蛋白表达及其与Nrf2的共定位ShamAValue(foldsvs.sham)0.0.2.4.6.81.01.21.41.6HO-1I/RVehicle2GPCL-NAME**#B图A-B：HO-1蛋白表达及其统计图；图C：HO-1与Nrf2蛋白的共定位，*p0.05VS.I/R组；#p0.05VS.vehicle2组；绿色：Nrf2；红色：HO-1；蓝色：DAPI；合成图为三者的共定位；40×；n=4-5；bar=50μm；CL-NAMEHO-1NeuNA小结4GPC可显著增加海马CA1区神经元胞核中Nrf2蛋白的表达并引起下游靶基因HO-1的表达，而L-NAME阻断了此作用。此结果进一步揭示GPC通过eNOS诱导了Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。海马是学习和记忆的重要部位，而海马CA1区是缺血最敏感的区域。那么，GPC是否能改善大鼠缺血后空间学习记忆能力?图7GPC对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响图A-B：潜伏实验和探索实验统计图；n=5；*p0.05vs.I/R组；#p0.05vs.GPC组.图C-D：潜伏实验和探索实验大鼠游泳路程轨迹图DC7d8d9dLatencytime(sec)020406080ShamI/RGPCL-NAMEDaysafterischemia**##AQuadrantOccupancy(sec)010203040506070ShamI/RGPCL-NAME*#Probetrial9dB小结5GPC能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力。四、总结1.GPC对缺血性神经元损伤具有保护作用。2.GPC可通过诱导eNOS磷酸化水平并上调Nrf2/HO-1信号通路，从而降低脑缺血诱导的氧化应激损伤。3.GPC能有效改善大鼠短暂全脑缺血后的认知功能。五、不足与展望1.GPC是否可增加Nrf2的DNA结合活性有待进一步研究。2.GPC是否也触发了其它促生存信号转导通路（如雌激素受体信号），从而起到抗缺血性神经元损伤的作用。其确切的机制还有待多层面、多角度的进一步探究。