2.2.1动物细胞培养和核移植技术

2.2动物细胞工程•生产单克隆抗体等动物细胞工程常用的技术•动物细胞培养•动物细胞核移植•动物细胞融合是其他动物细胞工程技术的基础。为什么要进行动物细胞培养?一.动物细胞培养如何进行细胞培养?2.2.1动物细胞培养和核移植技术从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。(一)概念实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？P44旁栏提示：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？P44寻根问底提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。(二)动物细胞培养过程•胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液10代细胞50代细胞剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶洗涤、稀释、分离原代培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越容易培养。动物细胞培养不能最终培养成生物体细胞增殖缓慢，核型可能变化动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型传代培养动物组织块细胞悬液原代培养传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎细胞贴壁接触抑制原代培养传代培养加入培养液用胰蛋白酶等处理贴壁细胞适宜条件不死性细胞细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养（一般）传代培养•原代培养和传代培养、细胞株和细胞系多数组织细胞固定在表面生长和分裂。叫做？随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？P46讨论充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境(三)动物细胞培养的条件P461、无菌、无毒环境（无菌处理和添加抗生素目的？更换培养液的好处？）2、营养与体内相同。合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。3、温度和PH，36~37℃、7.2~7.4）4、气体环境95%空气、5%CO2--维持培养液PH）植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白对比：动物细胞培养、植物组织培养..植物组织培养技术动物细胞培养技术原理培养基结果分散处理脱分化细胞全能性细胞有丝分裂固体,营养物质,激素液体,营养物质,血清等完整植株细胞群或细胞产物无有有无植物组织培养技术是植物细胞工程技术的基础。动物细胞培养技术是动物细胞工程技术的基础。复习植物细胞工程和动物细胞工程的部分内容。•P47最上面•1、大规模的生产生物制品。•2、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。•3、检测判断物质的毒性。•4、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于等，为及其他疾病提供理论依据。(四)动物细胞培养技术的应用筛选抗癌药物治疗和预防癌症1．关于动物细胞培养的有关叙述中正确的是A．细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中B．动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清C．动物细胞培养的目的只是获得大量的细胞分泌蛋白D．动物细胞培养前和培养过程中都需要用胰蛋白酶处理相互接触接触抑制单层胰蛋白酶衰老或死亡不死性降低减少活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入细胞，故不染色。中低温新陈代谢酶抗原二.动物细胞核移植技术和克隆动物将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易(一)、动物细胞核移植概念：(二)、体细胞核移植的过程：请看教材P48图2-21思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎卵母细胞采集、培养MⅡ期卵母细胞供体牛供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）•整个过程用了哪些技术？–细胞培养、核移植、胚胎移植•新生牛的性别、基因？–与供体相同•繁殖方式？–无性繁殖•原理？–动物细胞核的全能性(二)、体细胞核移植的过程：母绵羊A乳腺细胞（体细胞）母绵羊B未受精的卵细胞母绵羊C“多莉”新的卵细胞发育成早期胚胎去核卵细胞提取细胞核核移植胚胎移植体细胞核移植技术克隆羊步骤一：从一只6岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤二：从一头苏格兰黑面母绵羊（B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”步骤三：利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。换言之，多莉有3个母亲：基因母亲，提供基因组；线粒体母亲，提供去核卵细胞；代孕母亲，将多莉生下来。有意思的是虽然有三个母亲但多莉没有父亲。P49讨论：1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏(P49小资料）。培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。(三)、体细胞核移植技术的应用前景：1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病•阅读课本P50页(四)、体细胞核移植技术存在的问题：思考与探究1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。思考与探究2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。动物细胞培养与植物组织培养的重要区别在于[]A、培养基不同B、动物细胞培养不需要在无菌条件下进行C、动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能D、动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株巩固练习A动物细胞工程技术的基础是[]A、动物细胞融合B、胚胎移植C、动物细胞培养D、核移植巩固练习在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是[]A、细胞系B、细胞株C、原代细胞D、传代细胞CA下列不属于克隆的是[]A、生物体通过体细胞进行的无性繁殖B、将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系C、扦插和嫁接D、将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA中巩固练习D植物体细胞杂交的结果是[]A、产生杂种植株B、产生杂交细胞C、原生质体的融合D、形成愈伤组织巩固练习A植物体细胞杂交的目的是[]A、产生杂种植株B、产生杂交细胞C、原生质体的融合D、形成愈伤组织A植物体细胞杂交可以解决不同生物之间[]的问题A、亲缘关系远B、地理隔离C、生殖隔离D、组织分化巩固练习下列细胞中，不具有细胞全能性特点的细胞是[]A、心肌细胞B、神经细胞C、根的皮层细胞D、木质部导管细胞CD知识拓展1.动物细胞培养技术是如何发展起来的？1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液