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主讲人：xxx小组成员：xxx双水相萃取展望设备流程原理发展一、双水相萃取发展历程1896年，荷兰生物学家Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混合时，得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相。上相富含明胶，下相富琼脂(或淀粉)，且两相的大部分是水，这种现象被称为聚合物的不相溶性，双水相体系的形成主要是由于聚合物之间的不相溶性(incomPatibility)[1]。1956年瑞典lund大学的Albertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究，测定了许多双水相系统的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞以及细胞颗粒在双水相中的分配行为，为双水相体系统的发展奠定了基础[2]。只局限于实验室内的测定和理论研究。发展历程[1]BeijerinckMW.Uebereineeigentiimlichkeitderlöslichenstärke.CentblBakteriolParasitenkdInfektkrankh2Abt1896;2:697–9.[2]AlbertsonPA.Chromatographyandpartitionofcellsandcellfragments[J].Nature,1956,177：771～774，Kula教授研究小组对双水相的应用，工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20Kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离[3,4]。双水相萃取可分离多肽，蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织、以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素，氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。发展历程[3]KulaMR,KroneKH,HustedtH.AdvancesinbiochemicalEngineering,editedbyFiechteA,Berlin,Heideberg,NewYork1982,24:73~118[4]HustedtH,KroneKH,MengeU,etal.Proteinrecoveryusingaqueoustwo-phaswsystem[J].TrendsinBiotechnol,1985,31(6):1391989年，Diamond等人以Flory-Huggins理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但有局限性，人需继续探索，不断完善[5]。20世纪90年代以来，由于控制和优化技术的发展，将生化分离过程进行集成化和将生化反应与分离过程集成化成为了研究热点。发展历程[5]DoamondAD,HsuJT.Fundamentalstudiesofbiomoleculepartitioninaqueoustwo-phasesystem[J].BiotechnologyandBioengineering,1989,34:1000~1014.二、双水相萃取基本原理2.1双水相体系的形成当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液,或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时,能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系,这就是双水相体系。从溶液理论来说,当2种有机物或者有机物与无机盐混合时,是分相还是混合成一相,取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力。由于双水相体系本身的复杂性,体系的熵很难准确计算,分子间的相互作用力也不清楚,所以双水相的形成机理很复杂[6]。[6]辜鹏，谢放华，黄海艳，等.水相萃取技术的研究现状与应用[J].化工技术与开发2007,36(11):29-33基本原理对于高聚物/高聚物双水相体系,用传统的理论来解释,是由于界面张力等因素形成两相之间的不对称,使得在空间上产生阻隔效应,使两相之间无法相互渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,一般这种分离倾向的大小和形成双水相的2种物质的疏水性成线性关系。在水溶液中，聚合物的长链分子通过氢键同周围的水分子发生强烈地相互作用，每一个氧原子结合两个水分子，使溶液中的PEG分子被一层高度有序的水合作用层所包围。葡聚糖虽无与PEG类似的结构，但同样，分子中的羟基通过氢键作用在分子周围形成水分子层。基本原理某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为‘盐析’作用。图2.1Dex-PEG双水相系统相图基本原理双节线临界点两相区系线TMBC由表1可知,不同的成相原理可以解释不同组成的双水相体系,但各种原理并不能普遍适用,而且各种原理间的相互关系也十分复杂。因此双水相体系的成相原理以及溶液理论有待进一步深入研究。基本原理2.2双水相萃取基本原理双水相萃取原理示意图基本原理双水相萃取与一般的水—有机物萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同,物质进入双水相体系后,由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用,目标物质在上、下相中的浓度不同,从而达到分离的目的。溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系中服从Nernst分配定律:K=ct/cb其中ct、cb分别代表溶质在上相、下相中的浓度基本原理系统固定时,分配系数为一常数,与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后,在上相和下相间进行选择性分配,这种分配关系与常规的萃取分配关系相比,表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0101,因此为物质分离提供了可能[7]。[7]严希康,俞俊棠.生化分离工程[M].北京:化学工业出版社,2001.1692187.基本原理三、双水相萃取基本流程3.1双水相体系分类双水相体系主要有以下几种：（1）高聚物/高聚物双水相体系（2）高聚物/无机盐双水相体系（3）低分子有机物/无机盐双水相体系（4）表面活性剂双水相体系下面以高聚物/无机盐双水相体系为例来讲双水相萃取技术的工艺流程基本流程3.2双水相萃取的工艺流程ATPE（双水相萃取）技术的工艺流程[8]主由三部分构成：ATPE技术工艺流程目的产物的萃取PEG（聚乙二醇）的循环无机盐的循环[8]胡松青，李琳，郭祀远，等.双水相萃取技术研究新进展[J].现代化工，2004，24(6)：22-25.基本流程ATPE工艺流程图如下所示：匀浆液PEG+盐ATPE上相（产物）下相（废料）上相（PEG、杂蛋白）下相（目的产物）ATPE分离器+盐PEG循环图1双水相萃取原则流程图基本流程ATPE的工艺流程图图2连续错流（2步）萃取回收酶的流程图图3三步双水相系统萃取酶的一般流程图基本流程3.2.1目的产物的萃取原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入分离器分相。通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相），而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐相）。第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相，方法是在上相中加入盐，形成新的双水相体系，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超滤或透析将PEG回收利用和目的产物进一步加工处理。基本流程3.2.2PEG的循环在大规模ATPE过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG；②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。基本流程3.3.3无机盐的循环将含无机盐相冷却，结晶，然后用离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。基本流程3.4双水相萃取的应用双水相萃取主要有以下几个方面的应用：1在生物工程中的应用2在药物分析中的应用3在金属分离中的应用4双水相萃取分析5在其他方面的应用基本流程双水相萃取在生物工程中有着广泛的应用，可以萃取分离抗生素、酶、分离提纯蛋白质及萃取其他生物活性物质。(1)萃取分离抗生素朱自强等[9]用8%的PEG2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相体系直接萃取青霉素G发酵液，分配系数高达58.39，浓缩倍数为3.53，回收率为93.67%，青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13.36和21.9。(2)萃取分离酶Babu等[10]用18%的PEG1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶，菠萝蛋白的纯化倍数为4.0，酶活性恢复达到22.8%，而多酚氧化酶的纯化倍数2.07，酶活回收率达到90%。黄瑛等[11]采用10%的PEG2000、15%的磷酸盐和1%的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶，当系统的pH为8.0时，分配系数4.36，纯化因子3.98，脂肪酶的回收率达到87.25%。[9]朱自强，关怡新，李勉.双水相系统在抗生素提取和合成中的应用[J].化工学报，2001，52(12):1039—1048.[10]BabuBR,RastogiNK,RaghavaraoKSMS.LiquidLiquidExtractionofBromelainandPolyphenolOxidaseUsingAqueousTwo-PhaseSystem[J].ChemicalEngineeringandProcessing,2008,47(1):83—89.[11]黄瑛，尹利，闫云君.双水相萃取法分离纯化洋葱假单细胞菌G-63脂肪酶[J].现代化工，2007，27(z2)：300—302.3.4.1在生物工程中的应用基本流程3.4.1在生物工程中的应用(3)分离提纯蛋白质Silva等[12]研究了不同分子量的PEG和pH值在聚乙二醇(PEG)+磷酸钾+尿素+水双水相体系中的液-液平衡，描述了实验技能和分析方法，得出了25℃时PEG(1450，3350，10000)+磷酸钾(pH7和9)+尿素(质量分数为6%)+水的双水相体系的平衡数据。每个体系测得了4条连接线。研究了25℃时pH7和9，尿素质量分数为3%和6%的体系中溶解酵素、过氧化氢酶、β-牛乳糖的分离现象。(4)萃取其他生物活性物质Salabat等[13]研究了L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸3种氨基酸298.15K时在聚乙二醇+盐+水双水相体系中的分离现象，分相盐为硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵，并且还研究了连接线长度、盐、侧链结构对氨基酸分配系数的影响。结果表明，增加氨基酸的疏水性和连接线的长度会使分配系数相应的增加。另外，含有Na2SO4的体系比其他2种盐氨基酸的分配系数大。实验数据由改进后的Virial-type模型计算，比较模型与实验数据得出具有很好的一致性。[12]SilvaLHMdMeirellesAJ.ProteinPartitioning[J].J.Chem.Eng.Data,2001,46(2):251-255.[13]SalabatA,AbnosiMH,MotahariA.InvestigationofAminoAcidPartitioninginAqueousTwo-PhaseSystemsContainingPolyethyleneGlycolandInorganicSalts[J].J.Chem.Eng.Data,2008,53(9):2018—2021.基本流程3.4.2在药物分析中的应用双水相萃取技术作为一种新型的萃取技术已经成功地应用于药物分析中。梁华正等[14]研究有机溶剂/磷酸氢二钾双水相体系对栀子黄废液中栀子苷的萃取条件，并将萃取后的栀子苷用于栀子蓝色素的生产。根据分相后上下相中栀子苷的分配系数及两相体积比，选择合适的双水相体系，并改变溶剂与废液的体积比、磷酸氢二钾加入量、废液pH值以及萃取温度等参数，研究萃取栀子苷的最佳条件。实验结果表明，乙醇/磷酸氢二钾为合适的萃取体系。当双水相体系总量为10mL时，乙醇与栀子黄废液的体积比为6∶4，