RT-PCR原理及载体选择

12表达载体表达载体（Expressionvectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。表达载体是基因表达的核心元件。3实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号的积累实时监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。4RT-PCR原理荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。5RT-PCR原理CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数——具有重现性。6RT-PCR的数学原理7CT8PCR反应的对照9PCR反应条件10TaqMan探针法11SYBRGreenI荧光染料法SYBRGreenI是一种只与dsDNA小沟结合的具有绿色激发波长荧光染料。12SYBRGreenI—原理13两种方法的比较14荧光定量的解析方法15PCR反应体系10×PCRBuffer(含Mg2+)2uLdNTPs(各2.5mmol/L)2uL引物(10umol/L)各1uL模板20～40ngrTaqDNA聚合酶0.5U±加双或三蒸水至20uL16绝对定量分析法根据起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，再根据样品的CT值就可以计算出样品所含的模板量。