高分辨率溶解曲线HRM

SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（HighResolutionMelting）突变筛查和基因分型系统北京思博全科技有限公司内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）•高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：PCRTube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突变检测原理Lightscanner高分辨溶解曲线结果SaturatingdyeLCGreenplus——高分辨溶解曲线专用荧光染料内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器MutationScanning未知SNP扫描M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。BernhardJ.HoWnger·Hai-ChunJing·KimE.Hammond-Kosack·KostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet(2009)119:851–865DOI10.1007/s00122-009-1094-2数据来自英国洛桑农业实验站Bernhard等对Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外显子进行突变扫描结果内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器SmallAmpliconGenotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定•使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(~61℃),高温内标Tm(~92℃)•内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。•PCR片段的Tm值范围：70-88℃•优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型为何要使用温度内标ATSNPwithoutCalibration–72bpApplyTemperatureCalibrationATSNPwithCalibrationSmallAmpliconGenotypingM.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器HRM–LunaprobegenotypingHRM–Lunaprobegenotyping1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs1Probe–1SNP,AllPossibleSNPsClass1C:T,G:AClass2C:A,G:TClass3C:GClass4A:T1Probe,2SNPs,1Amplicon2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFEAmpliconScanning–发现新的突变DavidDe，YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding(2010)25:67–90rrRRRrMixRr:rrby1:1RrrrMixRR:Rrby1:1RRRr内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器RosarioMuleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSRDCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。RosarioMuleo等得出结论：HRM是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法。RosarioMuleo,MarirChiaraColao,DarioMianoatel.2009Genome52:252-260内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器2005LightScanner96/384•96/384孔板•~8分钟/板•~2-6秒/样品•温度均一性：0.15oC•数据采集速度：大于100pts/秒•升温速度：0.1oC/秒2010LS32•32样品转盘,玻璃毛细管•HRM检测•60分钟内完成定量PCR和HRM检测•HRM检测升温速度可以在0.05～0.90oC/秒之间调节•在升温速度小于≤0.3℃/秒时，温度均一性：±0.05oC•数据采集速度：20pts/秒～400pts/秒（与升温速度有关）•0.3oC/秒升温速度=67pts/℃•0.05oC/秒升温速度=400pts/℃LightScanner高分辨溶解曲线应用LunaProbes非标记探针基因分型未知SNP扫描SmallAmplicon小片段基因分型HRM分析流程在PCR反应前加入LCGreen荧光染料•时间大约2小时（包含试剂准备）在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析•大约需要5-10分钟数据分析和处理•大约需要5-10分钟PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如需要）•大约需要30-60分钟LightScanner适于SNP分析1.速度、通量—LightScanner5～10分钟完成96/384孔板的PCR产物检测，20000个SNP/天2.可检测未知、已知突变，对已知突变进行Genotyping3.检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7%（400bp）4.重复性—LightScanner重复性100%5.费用—LightScanner检测SNP每个样品的荧光染料成本为1.6RMB6.操作—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型，PCR产物不需要处理谢谢！