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CodeNo.：D406CompetentCellPreparationKit（200次量）目录内容页码●制品说明1●制品内容1●制品保存1●使用注意1●感受态细胞的制备方法1●感受态细胞的DNA转化2●实验例2●相关试剂及培养基的制备方法3■Ampicillin3■IPTG3■X-Gal3■LB培养基3■LB/Amp培养基3■SOB培养基3■SOC培养基4■φb×broth4■LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基4●制品说明大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（PlasmidDNA、PhageDNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（CompetentCell）。在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种：一种是购买商品化的感受态细胞，但商品化感受态细胞成本高、运输及保存有一定困难（超低温）；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。TaKaRaCompetentCellPreparationKit是一种方便、高效、快速制备感受态细胞的试剂盒。使用本试剂盒制备的感受态细胞可以满足大多数实验的需要，并且适用于几乎所有常用的大肠杆菌，例如：E.coliDH5α、JM109、CJ236、HB101、MV1184、BMH71-18mutS等，转化效率均可以达到1×106cfu/μgpUC19以上（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。使用本试剂盒制备的感受态细胞可以在-80℃保存一年。●制品内容（200次量）SolutionA20mlSolutionB20ml●制品保存：4℃保存。●使用注意1.制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷这些玻璃器皿或塑料容器时应尽量洗净。由于微量的洗涤剂或污染物都可能降低感受态细胞的转化效率，因此在洗刷完用于制作感受态细胞的专用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去离子水浸泡一晚，然后再充分洗净。2.制作感受态细胞时使用的菌种，不应使用4℃或常温保存的传代细菌。应使用-70℃保存的菌种，在LB/抗生素平板培养基上分级划线培养后，挑取单菌落。使用这种菌种制作的感受态细胞，能提高转化效率。3.培养感受态细胞制备用菌体时，OD600值的测定应随时进行，以使OD600值控制在0.35～0.5之间。如果OD600值超出此范围，可能降低感受态细胞的转化效率。4.用于感受态细胞制备的菌体培养停止后要立即处理，不要将培养液过长时间室温放置，在冰中放置时也不要时间过长。5.感受态细胞的制备操作过程中，离心后弃上清时要尽量弃尽，否则会降低感受态细胞的转化效率。6.使用SolutionA、SolutionB悬浮沉淀时要用手指轻轻弹动Microtube管壁，禁止剧烈振荡操作。7.为了有效确认感受态细胞的转化效率，最好制作一批高纯度的质粒DNA分装低温（-20℃）保存，用作阳性对照，以确认每批制作的感受态细胞的转化效率。●感受态细胞的制备方法1．菌种纯化。①使用LB/抗生素平板培养基（根据菌种性质加入适当的抗生素），用接种针挑取大肠杆菌（-70℃甘油保存菌），在平板培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜。②将上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。-1-2．菌体培养。①取20mlφb×broth移至100ml三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①的培养基中。③37℃振荡（约120rpm）培养。④测定OD600值，当OD600值达到0.35～0.5时（约培养5小时）放置冰中停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。⑤进行下一步操作。3．感受态细胞的制备①取上述菌体培养液1ml于1.5mlMicrotube中（根据需要量确定Microtube数量）。②1,500×g（一般的微型离心机约4,000rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。③在每个Microtube中加入100μl冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。④1,500×g（一般的微型离心机约4,000rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。⑤在每个Microtube中加入100μl冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。⑥感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。●感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化10分钟。2．取100μl的感受态细胞移至新的转化管中。3．向感受态细胞中加入0.1ng～10ng（3μl～10μl）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。4．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。5．加入890μl37℃预温的SOC培养基。6．37℃振荡培养1小时。7．取适量涂平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。8．确认培养菌落，进行下步实验。●实验例使用本试剂盒按标准操作方法制备了E.ColiK802感受态细胞，使用pUC19质粒1ng转化至E.ColiK802感受态细胞中，在含有Amp抗性的L-琼脂平板培养基上形成单菌落，计算菌落数及转化效率，结果见下表。表.E.ColiK802感受态细胞的转化效率Sample涂板量（μl）菌落数转化效率（cfu/μgpUC19）502985.96×106A1006406.40×106502424.84×106B1006216.21×106平均转化效率5.58×106-2-●相关试剂及培养基的制备方法■Ampicillin1.组份浓度：100mg/ml2.配制量：50ml3.配制方法：①称量5gAmpicillin置于50ml离心管中。②加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。③用0.22μm过滤膜过滤除菌。④小份分装（1ml/份）后，-20℃保存。■IPTG1.组份浓度：24mg/ml2.配制量：50ml3.配制方法：①称量1.2gIPTG置于50ml离心管中。②加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。③用0.22μm过滤膜过滤除菌。④小份分装（1ml/份）后，-20℃保存。■X-Gal1.组份浓度：20mg/ml2.配制量：50ml3.配制方法：①称量1gX-Gal置于50ml离心管中。②加入40mlDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50ml。③小份分装（1ml/份）后，-20℃避光保存。■LB培养基1.组份浓度：1%（W/V）Tryptone0.5%（W/V）YeastExtract1%（W/V）NaCl2.配制量：1L3.配制方法：①称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。③滴加5NNaCl（约0.2ml），调节pH值至7.0。④加去离子水将培养基定容至1L。⑤高温高压灭菌后，4℃保存。■LB/Amp培养基1.组份浓度：1%（W/V）Tryptone0.5%（W/V）YeastExtract1%（W/V）NaCl0.1mg/mlAmpicillin2.配制量：1L3.配制方法：①在1LLB培养基中加入1mlAmpicillin（100mg/ml）后均匀混合。②4℃保存。■SOB培养基1.组份浓度：2%（W/V）Tryptone0.5%（W/V）YeastExtract0.05%（W/V）NaCl2.5mMKCl10mMMgCl22.配制量：1L3.配制方法：①配制250mMKCl溶解。在90ml的去离子水中溶解1.86gKCl后，定容至100ml。②配制2MMgCl2溶液。在90ml去离子水中溶解19gMgCl2后，定容至100ml，高温高压灭菌。③称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone20gYeastExtract5gNaCl0.5g④加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。⑤量取10ml250mMKCl溶解，加入到烧杯中。⑥滴加5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。⑦加去离子水将培养基定容至1L。⑧高温高压灭菌后，4℃保存。⑨使用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。-3-■SOC培养基1.组份浓度：2%（W/V）Tryptone0.5%（W/V）YeastExtract0.05%（W/V）NaCl2.5mMKCl10mMMgCl220mM葡萄糖2.配制量：100ml3.配制方法：①配制1M葡萄糖溶液。称量18g的葡萄糖溶于90ml去离子水中,充分溶解后定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。②向100mlSOB培养基中加入除菌的1M葡萄糖溶液2ml，均匀混合。③4℃保存。■φb×broth1.组份浓度：2%（W/V）Tryptone0.5%（W/V）YeastExtract0.5%（W/V）MgSO4·7H2O2.配制量：1L3.配制方法：①称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone20gYeastExtract5gMgSO4·7H2O5g②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。③滴加1NKOH，调节pH值至7.5。④加去离子水将培养基定容至1L。⑤高温高压灭菌后，4℃保存。■LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基1.组份浓度：1%（W/V）Tryptone0.5%（W/V）YeastExtract1%（W/V）NaCl0.1mg/mlAmpicillin0.024mg/mlIPTG0.04mg/mlX-Gal1.5%（W/V）Agar2.配制量：1L3.配制方法：①称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。③滴加5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。④加去离子水将培养基定容至1L后，加入15gAgar。⑤高温高压灭菌后，冷却至60℃左右。⑥加入1mlAmpicillin（100mg/ml）、1mlIPTG（24mg/ml）、2mlX-Gal（20mg/ml）后均匀混合。⑦铺制平板（30～35ml培养基/90mm培养皿）。⑧4℃避光保存平板。-4-V2006.09