扫描电子显微镜样品的制备

扫描电子显微镜样品的制备样品制备技术的重要性样品制备工作是电镜工作中最繁重、最艰难的工作，又是最重要的环节，熟悉和掌握样品制备技术是应用电镜来解决问题的首要条件。根据电镜的类型、研究目的和样品类型及状态的不同，相应采用不同的制样方法。制样方法的选择和制样过程的技术控制将直接影响观察和分析的结果。电镜观察前为什么要制样大多数电镜在高真空条件下观察分析样品，应该从电镜的环境、样品的特点、及观察研究材料的目的要求等方面来考虑：1.在电镜高真空或超高真空中，含水样品（如大多生物样品、高分子样品）会急剧变形或对真空造成影响，故需事先脱水干燥；2.非金属样品在电镜观察时，容易发生荷电现象，应进行导电处理（金属镀膜、喷碳、组织导电等）；送检样品须知1.送检样品必须为干燥固体、块状、片状、纤维状及粉末状均可。2.应有一定的化学、物理稳定性，在真空中及电子束轰击下不易分解、挥发或变形。3.样品无腐蚀性、放射性和磁性。选择不同的制样方法：电镜的类型(扫描电镜,透射电镜,电子探针)要求,研究目的,样品类型形貌观察1.环境扫描电镜二次电子图像观察的样品制备2.高真空扫描电镜二次电子图像观察的样品制备3.背散射电子图像观察的样品制备成分分析X射线微区分析的样品制备技术结构分析背散射电子衍射的样品制备技术扫描电镜样品制备基本流程前处理装台粘胶导电处理上机样品类型●块状、片状、纤维样品大多样品仅受样品台尺寸的限制，如金属和陶瓷等样品只需用溶剂清洗或超声波清洗保证表面清洁，避免镜筒污染和对表面形貌的遮盖。如需观察内部结构，应采用其他制样方法。●粉末样品湿法用适合的分散剂在超声波清洗器中分散干法适宜于不易团聚的样品导电处理表面导电处理采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、银、钯及碳等蒸发后覆盖在表面的方法。为入射电子提供通路，消除电荷积累的荷电现象提高二次电子发射率，增加信噪比，提高图象反差，以便获得细节丰富和分辨率高的图象提高样品表面的机械强度，增强耐受电子束轰击的能力通过镀膜把扫描电镜的信息来源限定于样品表面，防止来自于样品组织内部的信息参与成像。导电处理--真空镀膜法原理：利用真空镀膜仪在高真空下使金属加热到熔点以上时，蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，由于金属的沉积使样品表面形成薄金属膜。缺点：金属颗粒粗，膜不均匀，操作费时。目前较少使用，主要用于制碳膜、碳复型膜和金属投影。导电处理--离子溅射法利用离子溅射仪在低真空中进行弧光放电时，由于离子冲击，阴极金属物质溅射到样品表面。原理：真空度达到１０-１Ｐａ时，在阴极和阳极之间加上１０００-３０００Ｖ的直流电压，两极之间产生弧光放电的电场。在电场作用下，罩内残余气体被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引到样品表面而形成金属导电膜。离子溅射的优点粒子细，岛状结构少，膜层均匀；对于凹凸不平的样品，也能形成很好的金属膜所需真空度低，操作简单，节省时间缺点不能镀碳膜，无法制做用于Ｘ射线微区分析的样品不具备投影功能，也不适于做复型电子束和离子的冲击使软组织样品易受损伤导电处理--组织导电利用某些金属盐溶液（单宁酸、碘化钾、醋酸铅）对组织中的蛋白质、脂肪及淀粉的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属化合物。优点提高样品的耐受电子束轰击的能力提高导电率提高分辨率（２０Å）加强固定效果样品不易产生收缩或损伤，细胞器保存完整环境扫描电镜样品制备环境扫描电镜的样品室会通入气体或者水分而处于低真空的“环境”状态，根据气体电离及放大原理，非导体及含水样品可以不经表面喷涂处理（喷金或喷碳）就能直接观察。环境扫描电镜可以对各种固体和液体样品进行形态观察和元素（C-U）定性定量分析，对部分溶液进行相变过程观察。对于生物样品、含水样品、含油样品，既不需要脱水，也不必进行导电处理，可在自然的状态下直接观察二次电子图像并分析元素成分。高真空扫描电镜样品制备1.粉末样品的制备湿法:用适合的分散剂在超声波清洗器中分散干法:适宜于不易团聚的样品2.块状样品的制备将欲观察样品的有规律地粘结在样品台上特殊表面处理--表面蚀刻表面蚀刻是SEM样品制备的重要方法之一。特别适用于对大块样品内部的结构形态和多相复合体系的相分布研究。蚀刻法样品制备主要是基于如下原理：即利用蚀刻剂与样品中不同组份或不同结构区域之间相互作用速率或程度的不同，因而可以有选择或优先地溶解或破坏其中的某一相或组份而保留下另一相或组份。因此，蚀刻法可用于研究高聚物的结晶形态，以及共混或填充高聚物中的相分布状态和各相之间的相互作用状况；无机复合材料的相结构形态等。表面蚀刻根据蚀刻剂的类型以及其与样品之间的相互作用方式，蚀刻法大体可以分为溶剂蚀刻，氧化剂蚀刻和等离子体蚀刻三大类。溶剂蚀刻利用溶剂对样品中不同组份的选择性溶解；氧化剂蚀刻利用样品中不同组份抗氧化能力的强弱；等离子体蚀刻利用样品不同组份抗等离子体轰击能力的强弱。蚀刻效果取决于蚀刻剂的选择性和蚀刻条件的控制。图2.乙烯-丙烯嵌段共聚物SEM像(早期文献照片）制样条件：恒温结晶，铬酸蚀刻图3.聚乙烯/等规聚丙烯共混物SEM像(早期文献照片）制样条件：恒温结晶，铬酸蚀刻图1.HIPS树脂SEM像(早期文献照片），溶剂蚀刻，可见橡胶相被溶解后留下的空隙3.截面样品的观察将所观察的样品侧贴在模块侧面（如图所示）特殊截面：冷冻断裂、常温脆断和常温掰断常常被分别用于SEM实验的生物样品、高聚物、硅面生长的线状和膜状等材料样品的制备，以观察内部结构或厚度结构。土豆的冷冻断裂面（早期文献照片）聚乙烯球晶冷冻断面复型（早期文献照片）扫描电镜中生物样品的制备组织或器官取材标本清洗a.固定前清洗b.固定后清洗c.离心清洗扫描电镜样品制作的简单流程取材（做好样品观察面的标志）——漂洗（生理盐水或缓冲液）——固定（2.5%戊二醛4小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定（1%锇酸，2小时）——酒精脱水（50%、70%、80%、90%、95%各15分钟，换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟）——干燥（零界点干燥或冷冻干燥）——镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）注意事项：1、由于扫描电镜对样品表面的要求非常严格，必须清洗干净，否则，可导致观察困难或错误判断。2、取材时要做到“动作快、环境冷、部位准”。固定前清洗的组织离体后应在2—3分钟清洗完毕并投入固定液内；固定后清洗的组织离体后应在1分钟以内投入固定液。固定液要预冷，取材部位必须准确。3、实验动物取材部位不宜多，否则会延误取材时间，导致组织自溶等人为假象的发生。4、植物样品在取了样品后要抽真空，使细胞壁间隙的气体抽出，减少气压，有利于固定液的渗透。E.Coli前固定后未彻底漂洗干净,背景为戊二醛结晶背散射电子图像观察的样品制备样品(粉末、块体)的准备与二次电子图像的样品准备相似。电子背散射图像由形貌衬度和原子序数两部分叠加而成。如果样品表面表面存在不平整的现象会造成了显微形貌有差异的区域，背散射电子的产额减少，在图像中呈现暗区；但是样品内的组成元素相差较远，其平均原子序数较高的部位比平均原子序数较低的部位亮，通过这一亮度上的差别，可以将原子序数低的区域和原子序数高的区域明显区分。由于背散射电子图像观察的样品与原子序数有关，所以在喷镀处理时要记得不能采用喷金处理，最好选择喷碳处理。Pb处理的植物根系的二次电子图像与背散射电子图像X射线微区分析的样品制备技术定量分析的试样要求试样制备方法定量分析的试样要求在真空和电子束轰击下稳定试样分析面平、一般要求垂直于入射电子束试样尺寸大于X射线扩展范围有良好的导电和导热性能均质、无污染试样制备方法EDS的定量分析结果的准确性与试样制备技术密切相关，要根据试样的不同特点，制备满足定量分析要求的试样。实际分析中，许多情况下无法得到平的试样，如粉末、断口及不能破坏的零部件等。这类试样仍然可以用EDS分析，虽然定量准确度少差，但许多情况下可以满足实际要求，例如金属中夹杂、玻璃中结石等。现在以无机材料为例，说明常碰到的几种试样类型的制备方法，包括形貌观察的试样。试样制备方法粉末试样制备小颗粒试样块状试样粉体试样制备1、粉体可以直接撒在试样座的双面碳导电胶上，例如玻璃板压紧，然后用洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。2、粉体可以撒在有液体导电胶的试样座上。3、当颗粒比较大时，例如大于5um，可以寻找表面尽量平的大颗粒直接分析。4、可以将粗颗粒粉体用环氧树脂等镶嵌材料混合后，进行粗磨、细磨及抛光方法制备。小颗粒试样小于5um小颗粒，严格讲不符合定量分析条件，但实际工作中有时可以采取一些措施得到较好的分析结果。对粉体量少只能用EDS分析时，要选择粉料堆积连续的区域，以免激发出试样座成分。为了获得粉体的平均定量结果，往往用扫描的方法（例如1000倍，扫描范围100um）块状试样块状试样可直接研磨和抛光，或镶嵌后研磨、抛光。对测定薄膜厚度、元素扩散深度、离子迁移深度、背散射电子观察相分布等试样，应用环氧树脂等镶嵌后，进行研磨和抛光。如果直接研磨和抛光容易产生倒角，会影响薄膜厚度及离子迁移深度的测定，对尺寸小的试样只能镶嵌后加工。块状试样—真空镶嵌方法将试样用环氧树脂胶浸泡，在50°C--60°C时放入低真空容器内抽气，然后在60°C恒温烘箱内烘烤4h，可获得坚固的块状样品，这可以避免研磨和抛光过程中脱落。同时可以避免抛光物进入试样孔内引起污染。背散射电子衍射的样品制备技术由于电子背散射(EBSD)只发生在试样表面的较浅表层(几十个纳米的深度范围),所以试样表面的残余应变层(或称变形层、扰乱层)、氧化膜以及腐蚀坑等缺陷都会影响甚至完全抑制EBSD的发生,因此试样表面的制备质量,很大程度上决定着EBSD的质量。EBSD试样的制备比一般金相试样的要求更高。要求试样表面无应力层、无氧化层、无连续的腐蚀坑、表面起伏不能过大、表面清洁无污染。a.较差的图像b.较为理想的图像a-Fe试样的菊池线图对比（文献图片）39SEM样品制备一般原则为:A.显露出所欲分析的位置。（样品高低）B.表面导电性良好，需能排除电荷。（搭桥）C.不得有松动的粉末或碎屑(以避免抽真空时粉末飞扬污染镜柱体)。D.需耐热，不得有熔融蒸发的现象。E.不能含液状或胶状物质，以免挥发。F.非导体表面需镀金(影像观察)或镀碳(成份分析)。（粗金、细金）谢谢！41样品制备简单另外，现在许多SEM具有图像处理和图像分析功能。有的SEM加入附件后，能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等动态过程的观察。可以放到HOLDER上的，都可以直接观察。样品可以是自然面、断口、块状、粉体、反光及透光光片，对不导电的样品只需蒸镀一层20nm的导电膜。近年来可变压力SEM和环境SEM的发展，采用差分真空系统，使样品周围的真空度保持比较低或者可变，样品不论干湿，例如含有水分的动植物或绝缘体均可以直接观察。