试验八感受态细胞的制备与转化

实验八大肠杆菌感受态细胞的制备与转化实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。实验原理转化(Transformation)是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化中的受体细胞转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源DNA分子的受体细胞(Transformant)。实验原理实验原理本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。抗Amp宿主细菌含Amp培养基影响转化率的因素细胞生长状态和密度。转化的质粒DNA的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源DNA的污染。实验仪器超净工作台台式高速冷冻离心机恒温空气摇床恒温培养箱培养皿实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒实验步骤菌株活化感受态细胞制备外源DNA的转化实验步骤菌株活化1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4实验步骤感受态细胞制备4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min5.4000rpm离心5min,弃上清6.加入0.8ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7.4000rpm离心5min,弃上清8.加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油可－70℃长期保存实验步骤转化取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min于42℃水浴90S冰上放置2min加入800μlLB液体培养基于37培养1小时将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果对照组对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数实验结果实验报告写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂详细列出实验步骤；画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。1.在制备感受态细胞的实验中要注意哪些细节？2.影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？思考题