样品非靶向代谢组分析

1/18代谢组学分析（metabolomics）实验报告项目名称：委托单位：项目编号：检测人员：核验人员：技术服务部负责人：报告时间：2/18目录1.代谢组学实验原理........................................................................................................32.项目实验流程................................................................................................................43.实验仪器和试剂............................................................................................................54.实验方法........................................................................................................................54.1样品信息.........................................................................................................................54.2样本预处理方法.............................................................................................................54.3色谱-质谱分析................................................................................................................64.4数据处理.........................................................................................................................75.实验结果........................................................................................................................75.1实验质量控制.................................................................................................................75.2各组样本的典型代谢谱图.............................................................................................95.3数据分析.......................................................................................................................116.差异代谢物KEGG代谢通路分析.............................................................................177.实验结论......................................................................................................................178.参考文献......................................................................................................................189.附件总结......................................................................................................................183/181.代谢组学实验原理代谢组学（metabolomics）是在后基因组学时代兴起的一门跨领域学科，其主要目标是定量的研究生命体对外界刺激、病理生理变化、以及本身基因突变而产生的其体内代谢物水平的多元动态反应[1]。代谢组学诞生于上个世纪末，由英国伦敦帝国大学JeremyNicholson教授创立，之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。从分析技术的角度来看，非靶向代谢组学是尽可能多地定性和相对定量生物体系中的代谢物，最大程度反映总的代谢物信息。针对生物样本中小分子代谢物种类多、极性跨度大和浓度动态范围大的特点，色谱-质谱技术成为代谢组学研究最重要的工具。LC-MS是以高效液相色谱作为分离系统，高分辨率质谱为检测系统的一种串联分析平台；与其他色谱-质谱联用技术相比，LC-MS更适用于分析难挥发或热稳定性差的代谢物。超高效液相色谱通过应用1.7μm超细粒径填料填充的色谱柱，比传统HPLC的分析速度至少提高1倍，灵敏度和分离度提高数倍[2]，目前，超高效液相色谱与四级杆-飞行时间（Q-TOF）质谱联用技术已被广泛用于代谢组学研究。亲水相互作用色谱（HILIC）是专门针对强极性代谢物而开发的色谱柱，因拥有和反相色谱（RPLC）互补的选择性而得到广泛重视和应用。研究表明，HILIC-ESI（±）-Q-TOFMS能提供中心碳循环代谢的最大信息量[3]。基于超高效液相色谱-Q-TOFMS的非靶向代谢组学分析流程一般包括：样品预处理、代谢物提取、LC-MS全扫描检测、数据预处理、统计分析及差异物结构鉴定。本实验采用HILICUHPLC-Q-TOFMS技术结合数据依赖采集方式对样本进行全谱分析，同时获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用XCMS对数据进行峰提取和代谢物鉴定，简单工作流程见图1[4]。4/18图1实验流程图2.项目实验流程主要步骤包括：样品制备、QC制备、样品LC-MS/MS质谱分析、数据分析和实验报告等。代谢组学技术路线5/183.实验仪器和试剂TripleTOF6600质谱仪（ABSCIEX）Agilent1290InfinityLC超高压液相色谱仪（Agilent）低温高速离心机(Eppendorf5430R)色谱柱:Waters,ACQUITYUPLCBEHAmide1.7µm,2.1mm×100mmcolumn乙腈(Merck，1499230-935)乙酸铵(Sigma，70221)4.实验方法4.1样品信息待测样本信息：共2组样本，每组20份生物学重复样本（样本具体信息见表1）。质控样本（QC）的制备：分别取每个样本20μL，混合为QC。QC样本用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。表1样品信息样品分组样品名称数量样品状态1Control（C）20液体2Tb（Tg）20液体4.2样本预处理方法4℃环境下取每个样本100μL，加入400μL预冷甲醇/乙腈溶液（1:1，v/v），涡旋混合30s，-20℃静置20min，14000g4℃离心15min，取上清400μL，真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液（乙腈：水=1:1，v/v）复溶，涡旋，14000g4℃离心15min，取上清液进样分析。6/184.3色谱-质谱分析4.3.1色谱条件样品采用Agilent1290InfinityLC超高效液相色谱系统（UHPLC）HILIC进行分离。柱温25℃；流速300μL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；的梯度洗脱程序如下：0---1min，为85%B；1---12min，B从85%线性变化到65%；12---12.1分钟B从65%线性变化到40%，12.1---15min，B维持在40%；15-15.1分钟---B从40%线性变化到85%，15.1---20分钟，B维持在85%；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中每间隔5个实验样本设置一个QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。4.3.2Q-TOF质谱条件分别采用电喷雾电离（ESI）正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用TripleTOF6600质谱仪（ABSCIEX）进行质谱分析。HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：IonSourceGas1（Gas1）：60，IonSourceGas2（Gas2）：60，Curtaingas（CUR）：30，sourcetemperature：600℃，IonSaparyVoltageFloating（ISVF）±5500V（正负两种模式）；TOFMSscanm/zrange：60-1000Da，productionscanm/zrange：25-1000Da，TOFMSscanaccumulationtime0.20s/spectra,productionscanaccumulationtime0.05s/spectra；二级质谱采用informationdependentacquisition（IDA）获得，并且采用highsensitivity模式，Declusteringpotential（DP）：±60V（正负两种模式），CollisionEnergy：35±15eV，IDA设置如下Excludeisotopeswithin4Da，Candidateionstomonitorpercycle：6。7/184.4数据处理原始数据经ProteoWizard转换成.mzML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（25ppm）和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库。对XCMS提取得到的数据，删除组内缺失值50%的离子峰。采用Pareto-scaling方法进行归一化，然后应用MetaboAnalyst软件进行多维统计分析，包括无监督主成分分析（PCA）、有监督偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。单维统计分析包括t检验和变异倍数分析，R软件绘制火山图。5.实验结果5.1实验质量控制采用QC样本谱图比对和主成分分析两种方法，对本项目实验中的8次QC样本数据进行分析评价。1）QC样本总离子流图（TIC）的比较将8次分析得到的QC样本UHPLC-Q-TOFMS总离子流图，进行谱图重叠比较，见图2，结果表明各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小。8/18%Intensity(of1.5e8)%Intensity(of7.5e7)图2-1QC样品HILIC正离子模式TIC重叠图谱IDASurveyfromQC02AMIDENEG.wiff(sample1)-P15479-QCIDASurveyfromQC03AMIDENEG.wiff(sample1)-P15479-QCIDASurveyfromQC04AMIDENEG.wiff(sample1)-P15479-QCIDA