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RNA研究相关技术RNAresearch-relatedtechniquesandtheirapplication(进展)2010级硕士徐文弟2010年9月28日导论•再谈中心法则•RNA世界•RNA生物学功能•RNA组学再谈中心法则4中心法则与RNA1961年,发现DNA依赖的RNA聚合酶1968年,提出RNA是最早的信息分子1982~1983年,发现核酶1986年,提出“RNAworld”1947年,RNA第一次被描述1968年,提出中心法则中心法则与组学基因组：一种生物拥有的所有遗传信息的总合是一个细胞（或病毒）所承载的全部遗传信息，它代表了一种生物所具有的全部遗传信息。真核生物基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）及线粒体DNA或叶绿体DNA的全部序列，既有编码序列，也有大量存在的非编码序列。细菌基因组包含了拟核和质粒中的DNA序列。病毒基因组有的为DNA（DNA病毒），有的则为RNA（RNA病毒）。*基因组（genome）基因组学：包括结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学基因组学（genomics）是阐明整个基因组的结构、结构与功能的关系以及基因之间相互作用的科学。研究内容：结构基因组学（structuralgenomics）:遗传图谱、物理图谱、序列图谱以及转录图谱和大规模DNA测序。功能基因组学（functionalgenomics）:分析鉴定基因组功能。比较基因组学（comparativegenomics）：基因组之间比较鉴定，研究生物进化，预测新基因。转录组学：研究全部RNA的表达及功能•转录组（transcriptome）指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的所有RNA——包括指导蛋白质翻译的mRNA和非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)的总和。•RNA功能基因组学又称RNA组学（RNomics）：是分析、鉴定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定状态下表达差异、功能及其与蛋白质的相互作用。RNA组学：研究全部非mRNA小RNA的集合•人类基因组序列特点：2万2.5万个基因，与蛋白质合成有关的序列占整个基因组的2%左右，其余98%的基因组序列没有得到注释。•RNA组学研究范畴：小分子RNA，包括snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质即蛋白质组（proteome）为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态；了解蛋白质之间的相互作用与联系；并在整体水平上研究蛋白质调控的活动规律，故又称为全景式蛋白质表达谱（globalproteinexpressionprofile）分析。蛋白质组学（proteomics）蛋白质组：全景式蛋白质表达谱分析蛋白质组学的中心任务：研究细胞内所有蛋白质组成及其活动规律蛋白质组学的研究内容：一、蛋白质组表达模式的研究，即结构蛋白质组学（structuralproteomics）二、蛋白质组功能模式的研究，即功能蛋白质组学（functionalproteomics）蛋白质组学的主要任务：蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。翻译后修饰的鉴定：磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。与蛋白质组研究相关的数据库•蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；）•基因序列数据库（Genbank，，）•蛋白模式数据库（Prosite，）•蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，；FSSP，）•蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE）疾病基因组学：研究疾病相关基因、揭示疾病发病机制•疾病基因组学研究的两大任务：–疾病基因或疾病相关基因–疾病易感性的遗传学基础药物基因组学：研究遗传变异对药物效能和毒性的影响药物基因组学（pharmacogenomics）–是功能基因组学与分子药理学的有机结合，它不是以发现人体基因组基因为主要目的，而是运用已知的基因组学知识改善患者的治疗。–以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性的关系，是研究高效、特效药物的重要途径，通过它为患者或者特定人群寻找合适的药物。–使药物治疗模式：诊断定向治疗→基因定向治疗。肿瘤基因组解剖工程：阐明肿瘤相关基因基因激活和/或失活及其复杂的相互作用是肿瘤发生的根本原因癌症基因组解剖计划（CancerGenomeAnatomyProject，CGAP；又称肿瘤cDNA工程）：–拟逐步建立人类肿瘤细胞表达基因索引–发展快速分析肿瘤细胞的技术–获知与肿瘤相关的基因、蛋白质及其他生物标记物–建立肿瘤研究信息（数据与分析工具）、资源（克隆和文库）及技术和方法学平台•代谢组学（metabonomics）测定一个生物/细胞中所有小分子（Mr1000）组成，描绘其动态变化规律，建立系统代谢图谱，并确定这些变化与生物过程的联系。生命过程的表观、生物化学的终极目标。代谢组学：研究内源性代谢物质的动态变化规律及与生物过程的联系•代谢组学分为4个层次：①代谢物靶标分析（metabolitetargetanalysis）②代谢谱分析（metabolicprofilinganalysis）③代谢组学（metabonomics）④代谢指纹分析（metabolicfingerprintinganalysis）•代谢组学研究对象：生物体液——血样、尿样等完整的组织样品、组织提取液和细胞培养液（一）代谢组学的任务：分析生物/细胞代谢产物的全貌主要的分析工具①核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）：氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）及磷谱（31P-NMR）。②MS：MS按质荷比（m/z）进行各种代谢物的定性或定量分析，可得到相应的代谢产物谱。③色谱及联用技术：使样品的分离、定性、定量一次完成，具有较高的灵敏度和选择性。（二）代谢组学的主要分析工具：核磁共振、色谱及MS•代谢组学研究侧重于代谢物的组成、特性与变化规律，与生理学的联系更加紧密。•疾病→机体病理生理过程变化→代谢产物的改变→比较分析与正常人的代谢产物差异→发现和筛选出疾病新的生物标记物→对相关疾病作出早期预警→发展新的有效的疾病诊断方法。•药物代谢组学的研究，可阐明药物在不同个体体内的代谢途径及其规律，将为合理用药和个体化医疗提供重要依据。（三）代谢组学：是开展预测医学和个体化医学的重要手段RNA世界RNA是一种可以作为信使、酶和结构组分的多功能分子。RNA与DNA、蛋白质，甚至RNA本身都能发生相互作用，在生命活动的各个环节中发挥重要功能。大量非编码RNA的发现及其生物学功能多样性被揭示。核酶的发现使得人们相信在生命的进化过程中曾经存在着一个活跃的RNA世界。人们认识到RNA的研究在揭示生命本质和疾病防治方面都有着不可或缺的意义。•1982-1983年，ThomasCech和SidneyAltman等分别发现RNaseP的RNA亚基和嗜热四膜虫的前体rRNA中的居间序列(Interveningsequence．IVS)都具有酶的催化活性，它们是最早被发现的具有催化作用的RNA分子——核酶（ribozyme），为RNA转录后加工机制提供了新的认识，并为生命起源的探讨开拓了新的境界。•1986年，WalterGilbert创造了“RNAworld”这个名词，用于描述其提出的关于分子起源的假说：在生命进化的早期存在一个只有RNA，没有DNA和蛋白质的世界；RNA既是遗传信息载体又具有酶的催化功能，它们催化自身的合成。“RNA世界”目录TheRNAWorld(ThirdEdition,2006)RaymondF.GestelandThomasR.CechJohnF.AtkinsColdSpringHarborLaboratoryPress一、起源于RNA与RNA起源1.RNA的历史、化学、地理生物学2.对RNA世界起源认识的进展3.原始细胞：包含遗传聚合体的膜囊泡二、建立功能RNA4.核糖开关与RNA世界5.自我切割核酸酶的催化策略：RNA世界的遗迹？6.I型内含子如何起作用：RNA结构与功能的范例研究三、退出古老的RNA世界——合成酶与核糖体7.RNA、脂质、膜8.氨基酰-tRNA合酶9.RNA在蛋白质合成中的作用10.从RNA世界进化而来的核糖体与蛋白质翻译四、现代RNA世界中丰富的RNA角色11.核糖核蛋白世界12.不断扩展的小核内核糖核蛋白世界13.剪接体结构与功能14.RNA分子位点特异性修饰的范例：尿嘧啶插入、缺失RNA编辑15.端粒酶RNA16.形状多变的mRNA：折叠的得与失五、RNA继续战胜DNA17.II型内含子：一类剪接RNA并入侵DNA的核酶18.SINE和LINE：麻烦制造者、破坏者、先行者19.短RNA生物学20.细菌内小RNA调控子的多能性21.参与哺乳动物基因剂量调控的长链非编码RNA六、新兴工具22.RNA二级结构预测23.一种用于全原子RNA建模的模块层次方法24.功能RNA序列的自动化体外筛选与芯片应用25.基于单分子方法的RNA折叠、展开、动力学研究RNA有何基本特点与功能？RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。RNA比DNA小的多。RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。RNA的基本特点RNA生物学功能•构成核糖核蛋白体•小核内核糖核蛋白世界•剪接体结构与功能•RNA分子位点特异性修饰的范例：尿嘧啶插入、缺失•RNA编辑•端粒酶RNA•形状多变的mRNA：折叠的得与失RNA的种类、分布、功能核蛋白体RNA信使RNA转运RNA核内不均一RNA核内小RNA胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核蛋白体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNA核蛋白体RNA信使RNA转运RNA核内不均一RNA核内小RNA胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核蛋白体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNACrystalStructureoftheRibosomeat5.5ÅResolutionScience.2001.292:883-896.MaratM.Yusupov,1*GulnaraZh.Yusupova,1*AlbionBaucom,1KateLieberman,1ThomasN.Earnest,2J.H.D.Cate,3HarryF.Noller11CenterforMolecularBiologyofRNA,SinsheimerLaboratories,UniversityofCa