培养基及其设计、制备、优化

第三讲（2011.9.21）第四章培养基及其设计、制备、优化第一节培养基的类型第二节发酵培养基的成分及来源第三节发酵培养基的设计和优化5、生长因子、前体和产物促进剂从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。5.1生长因子如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。如：青霉素G生产添加苯乙酸，红霉素生产添加丙酸丙醇等，合成L-丝氨酸添加甘氨酸。5.2前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136用法：前体使用时普遍采用流加的方法（采取少量多次）前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率。5.3产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物，有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。6、水对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。第三节发酵培养基的设计和优化参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。1、培养基成分选择（设计）的原则1.1根据微生物的营养需求配制培养基1.2注意培养基营养物质的浓度和配比如蔗糖适当浓度是营养，高浓度则成为抑制因子。注意培养基的C/N对发酵的影响。如谷氨酸的发酵，C/N为4：1时，菌体大量繁殖，酸积累少，当C/N为3：1时产生大量的谷氨酸。1.3调节适当的物理化学条件1.3.1pH：发酵过程的酸碱度会发生变化，一般可考虑加入缓冲剂，如：KH2PO4K2HPO41.3.2渗透压和水分活度（Aw）：等渗溶液适宜微生物的生长。Aw表示微生物在天然环境中可实际利用的自由水或游离水的含量。Aw=P/P0，即某溶液的蒸汽压（P）与纯水的蒸汽压（P0）的比值。各种微生物的生长范围Aw：0.998~0.6，设计培养基时应考虑到Aw,G-生长的最小水分活度一般比G+高，表明通常G+比G-有较高的内部渗透压，酵母与G+类似，丝状真菌范围大。1.3.3氧化还原电势Eh：好氧微生物生长Eh为：+0.3~0.4V，兼性厌氧微生物为：0.1V，厌氧微生物为：0.1V。1.4根据培养微生物的目的配制：产物是菌体：N源含量比较高产物是某种代谢产物：考虑代谢产物的化学组成。1.5尽量使用廉价易得的原料（8个代替）以粗代精，以“野”代“家”，以废代好，以简代繁，以烃代粮，以纤代粮，以氮代朊，以“国”代“进”2、培养基的优化方法2.1生态模拟2.2查阅文献：直接、间接的信息。2.3借助优选法或正交试验法精心设计培养基的配方。2.4试验比较：实验规模一般由定性到定量，由小到大。摇瓶、反应器培养基研究的两个层次摇瓶——培养基设计的第一步反应器—扩大培养进一步进行配方优化第五章发酵培养基的灭菌技术及相关设备灭菌技术(工业生产、实验室）灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。工业上常用灭菌方法：干热灭菌法湿热灭菌法辐射（射线）灭菌法化学药品灭菌法过滤除菌法1、干热灭菌法：是一种极端的手段，温度高、时间长。原理：氧化作用是干热灭菌的主要根据。温度系数Q10，即温度升高10℃，灭菌速度常数增加的倍数。嗜热脂肪芽孢杆菌：2.86枯草杆菌黑色亚种：2.722、湿热灭菌2.1湿热灭菌的原理：是直接用饱和蒸汽进行灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，使微生物细胞中的蛋白质、酶、核酸极易发生不可逆的凝固变性，导致短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济快速等特点，因此发酵工业中处理大量培养基时广泛采用湿热灭菌。嗜热脂肪芽孢杆菌Q10：2.86(干热)14.28(湿热)枯草杆菌黑色亚种Q10：2.72(干热)3.71(湿热)2.2湿热灭菌理论灭菌时间的确定生产上要选择合适的时间和灭菌温度，既彻底灭菌又使培养基营养成分的破坏减至最底限度。杂菌在一定温度下，受热死亡遵循一级反应动力学的规律这就是对数残留定律。-dN/dt=kNN—菌的残留数（个）t—灭菌时间，dN/dt—菌的瞬时变化速率，个/sk—菌死亡的反应速度常数，1/s-dN/dt=kN积分得：t=2.303/k（lgN0/Ns）N0—灭菌初始时培养基菌数，个/mlNs—灭菌一时间段后培养基菌数，一般取0.001个/mlk表示微生物的耐热性。灭菌温度T与菌死亡反应速度常数K的关系：对于一定的菌种，灭菌温度与k的关系可用阿累尼乌斯方程表示：k=Ae-E/RT取耐热性芽孢杆菌的A、E值进行计算，lgk=14847/T+36.127式中A—阿累尼乌斯常数，1/SE—杀死细菌孢子的活化能，4.187J/molT—热力学温度，KR—气体常数，1.987×4.18J/(K.mol)e—2.713、工业生产培养基的灭菌3.1分批灭菌（实罐灭菌）3.1.1典型发酵罐接管图典型发酵罐接管图3.1.2分批灭菌的操作过程：a.培养基的预热：灭菌培养基需先加热到80—90℃，然后再导入蒸汽升温灭菌。预热目的是防止蒸汽直接导入培养基温差大，导致大量冷凝水，稀释了培养基；防止直接蒸汽导入引起泡沫急剧上升而溢料。预热方法是先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，等罐温升到80—90℃，将排气阀逐渐关小。b.将蒸汽从进气口、出料口、取样口直接导入罐内同时开排气管排气阀、补料管排气阀、接种管排气阀、消沫剂管排气阀，各路进、排气要通畅（三进四出），罐内液体翻动要剧烈，以使物料温度均一。c.排气量不宜过大，以节约蒸汽用量。d.罐温上升到120℃—130℃，罐压105Pa，保温30分e.灭菌将要结束时，立即用无菌空气保压（注意此时罐内压力必须低于过滤器压力，否则将出现培养基倒流），再开冷却水降温待种，以防罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气。3.2连续灭菌（连消）连续灭菌即培养基在发酵罐外经过一套连续灭菌设备，以比分批灭菌高的温度和较短的时间进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。3.2.1喷淋冷却连消流程培养液预热：待灭菌的培养液预热到60℃—75℃。连续灭菌：由连消泵送到连消塔式底，料液在此被加热到灭菌温度，由顶部流出，一般控制培养基输入连消塔的速度0.1m/min，温度132℃，在塔内的停留时间为20—30s。维持灭菌温度：连消后料液再输入维持罐保温一定时间。在生产实际中，一般维持5—8min。理论维持时间由t=2.303/k（lgN0/Ns）式求出。冷却：料液经喷淋冷却器冷却到生产要求的温度。进入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。3.2.2真空冷却连消流程由于负压培养基本身产生大量二次蒸气被抽出，消耗了大量热量，醪温迅速冷却。3.2.3板式换热器连消流程优点：结构紧凑，传热效率高，应用范围广。3.3连续灭菌与实罐灭菌的比较实罐灭菌：无需专用设备，培养基受热时间长，营养易破坏。对蒸汽的要求不是太高。连续灭菌：营养成分破坏少，适宜大规模生产，易于自动化控制，对蒸汽的要求高。3.4连续灭菌的主要设备喷嘴式连消塔套管式连消塔4影响培养基灭菌的其他因素实际灭菌中，除了杂菌的种类，数量，灭菌的温度和时间外，培养基的成分，pH值，培养基中颗粒与泡沫等对培养基灭菌也有影响。4.1pH值培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的酸度越大，所需杀灭微生物的温度越低，时间越短，pH值6-8时微生物最耐热。4.2培养基成分油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。4.3泡沫：灭菌应避免产生泡沫，因为泡沫能形成隔层，使热量难以传递，不易达到微生物致死温度。4.4培养基的物理状态：牛顿型培养基（细菌、酵母），非牛顿型培养基（放线菌、霉菌）固体培养基比液体培养基灭菌时间长，液体的传热效率高。4.5微生物细胞中水含量：在一定范围内，微生物细胞含水量越多，则蛋白质的凝固温度越低。4.6微生物的菌龄：年老细胞对不良环境的抵抗力比年轻细胞强，这与细胞中蛋白质的含水量有关，年老细胞中水份含量低。4.7微生物的耐热性：细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，而放线菌、霉菌孢子比营养细胞的抗热性强，细菌的芽孢抗热性更强。4.8培养基中微生物的数量4.9空气的排除4.10搅拌