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实验三放线菌、霉菌的形态观察及微生物的分离纯化一、实验目的观察放线菌、霉菌的形态结构特征学习掌握霉菌染色的基本方法基本掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌菌落形态特征实验（一）放线菌、霉菌的形态观察二、实验原理1、放线菌：放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，因菌落呈放射状而得名。放线菌的菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。它和细菌单染色一样，可用石炭酸复红和吕氏美蓝等染料着色后，在显微镜下观察它们的形态。放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所组成的单细胞菌丝体，菌丝内无隔膜，菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和有营养菌丝向上生长的气生菌丝，有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋状、波浪形或分枝状等，着生形式有丛生、互生和轮生三种。孢子的表面光滑或粗糙，圆或椭圆和干形。孢子有各种颜色。这些形态特点都是鉴别放线菌的重要依据。⑴营养菌丝：又叫初级菌丝体或一级菌丝体，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。营养菌丝一般无隔膜，直径0.2—0.8µ，但长度相差很大，短的小于100µ，长的可达600µ以上，有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、兰、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性（脂溶性）色素，则使菌落呈现相应的颜色，因此，色素是鉴定菌种的重要依据。⑵气生菌丝：又称二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。⑶孢子丝：当气生菌丝体发育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝，又名产孢丝或繁殖丝。放线菌最突出的特性之一是产生大量的、种类繁多的抗生素，根据估计，全世界共发现4000多种抗生素，其中绝大部分是由放线菌产生的。2、霉菌：霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮状或蜘蛛网状的丝状真菌统称霉菌。霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因此，在观察是要注意菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样着生的。由于霉菌的菌丝较粗大，而且孢子容易飞散，如将菌体置于水中容易变形，故观察时状不用水浸法制片，而将菌体置于乳酸石炭酸棉兰染液中，使细胞不易干燥，并有杀菌作用。根霉三、实验材料放线菌和真菌培养物1.放线菌培养物：链霉菌四天插片培养物。2.黑曲霉培养物。3.各种真菌示范片。显微镜、载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、酒精灯、镊子等。乳酸石炭酸棉兰染液、碘液、酒精、蒸馏水等四、实验步骤观察放线菌气生菌丝和基内菌丝的区别取插片一片，直接在显微镜下进行观察，注意分界面两侧菌丝形态的差异插片法培养放线菌2、霉菌：在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉兰→用解剖针取少许霉菌于染色液中→挑开菌丝→盖上盖玻片片→镜检。观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况（着重辨认分生孢子梗、足细胞和分生孢子）：观察根霉菌丝情况和子囊孢子情况（着重辨认孢子囊、包囊梗、假根）：五、实验结果记录所观察到的放线菌基内菌丝和气生菌丝的差别绘制青霉（40x）、黑曲霉（40x）的形态，注明各部分名称。1.为何要用乳酸石炭酸棉兰染液对霉菌进行染色?实验(二)、从土壤中稀释分离微生物一、实验目的：学习微生物稀释平板计数及划线分离技术二、实验原理:采用适宜(选择)培养基和培养条件，或加入某种抑制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法在固体培养基上形成单个菌落依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌落从而推算样品中含有多少细菌或真菌的活菌数目从土壤中稀释分离微生物的方法如下：（一）土壤悬液制备准备1瓶土壤悬液：称10克土壤放入带玻璃珠的90ml瓶装无菌水中，手摇振荡(10-20min)，使土样分散。三、实验步骤：（二）悬液稀释：方法见下图：（三）倒固体琼脂培养基平板：分离细菌的同学取一瓶牛肉膏培养基（200ml／瓶）熔化后加制霉菌素1ml后倒平板。分离真菌的同学取一瓶马丁-孟加拉红培养基（200ml／瓶）熔化后冷至50℃后加链霉素2ml倒平板。（四）悬液涂布(演示):无菌操作(从稀至浓将菌液涂布均匀)采用10－2，10－3，10－4稀释液涂布马丁－孟加拉红平板；采用10－3，10－4，10－5稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板,每人用剩下的1个平板做划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分离（演示）（五）培养：每个同学把平板用报纸包好（每个平板方向一致），写上班级和姓名，皿底朝上，置于培养箱培养(温度?!)。（六）检查结果平板涂布简单易行，但易造成机械损伤划线分离方式结果分析:1.我所涂平板种类：（牛肉膏或马丁氏）2.计数：牛肉膏平板取单菌落数目在30～300个左右的稀释度来计数，马丁氏平板取单菌落数目在10～100个左右的稀释度来计数3.我所计数的平板稀释度是：单菌落数目：、、。4.计算：活菌数目/每克土壤＝（计算过程）＝个/每克土壤5.对你和同伴的细菌及真菌计数结果进行分析实验报告从土壤中稀释分离微生物的原理、方法、步骤。2．思考题(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！所用器皿自己洗净！请第三组同学留下值日下周再见！