DNA修饰

第四节：DNA修饰•DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG岛的CpG二核苷酸的胞嘧啶5‘碳位共价键结合一个甲基基团。•作用：–是哺乳动物基因表达调控的主要形式。•DNA甲基化特点：–可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂能在细胞或个体世代间遗传；–是基因表达的改变;–没有DNA序列的变化，或不能用DNA序列变化来解释。CpG岛（CpGIsland）•CpG岛（CpGIsland）：–成簇的CpG二联体被称为“CpG岛”•CpG岛的结构特征：–一般以1－2kb的DNA长度范围内，（G＋C）含量超过60％（正常的为20％），并有高浓度的CpG二核苷酸，高出平均水平10～20倍。–CG岛通常是一些稀有的内切酶的切点，如果基因组中这种限制位点的紧密成簇，则表明含有CG岛，然后进行Southern印迹可鉴定基因。–人基因组内有45000个CpG岛，其中16000个在Alu序列中，还存在29000个CpG岛;–组成型表达的基因中100％含有CpG，在组织特异性表达的基因中40％有CpG。–没有甲基化的C极易变成U而被修复，甲基化C脱氨基后形成T，因此CpG序列容易丢失。–在两个CpG岛之间有8－10碱基的重复序列，该序列决定了甲基化发生的地点。DNA甲基化的作用•CpG占基因组的10％，其中70－80％为甲基化。•未甲基化的CpG岛处于组成性表达基因启动子的周围；也存在于一些组织特异性基因的启动子周围•CpG岛的甲基化改变了染色质结构，造成高度螺旋化，失去了DNase敏感性，阻止了启动子的活化，同时能够与甲基化CpG结合蛋白质结合，如组蛋白去乙酰化酶等，可以抑制基因的表达。•甲基化DNA可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、AP2、NF2KB、Cmyb、Ets使其失去结合DNA的功能，阻断转录•甲基化CPG粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1、CTF、YY1),使它们失活,从而阻断转录。5种带有甲基化DNA结合域(MBD)的甲基化CpG粘附蛋白(MECP2、MBD1、MBD2、MBD3；MBD1)有糖基转移酶活性,可将T从错配碱基对T－G中移去。•用组蛋白Hl与含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA实验后发现：–甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。•DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，影响蛋白质与DNA的相互作用；抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。•用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。•5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的，基因的5'端和3’端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关.•组织培养的细胞由于甲基化作用，使细胞系不能表达出相应的组织特异性蛋白质。•2006年制备了拟南芥的全基因组甲基化图谱，发现转录区域1/3以上的表达区域出现了甲基化；而启动子区有少于5％的基因出现了甲基化；在转录区域的甲基化表现出了明显的组织特异性。•甲基化通常发生于外源序列中，使其处于异染色质状态，是寄主抵御外源序列入侵的策略，是1种主动防御机制。DNA甲基化形成过程•在DNA甲基化过程中，胞嘧啶DNA双螺旋突出进入与酶结合部位的裂隙，通过胞嘧啶甲基转移酶把活性甲基从甲硫氨酸转移至5’胞嘧啶位上，形成5’甲基胞嘧啶。•2类甲基转移酶：–维持甲基化的DNA甲基转移酶Dnmtl：•使复制后形成的半甲基化DNA进行全甲基化；获得与亲本DNA完全相同的甲基化形式。•S期：Dnmt1与其相关蛋白DMAP1共同定位于复制叉处–重新甲基化的DNA甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b：•在没有甲基化的DNA双链上进行甲基化•在不同的细胞周期其位置会发生改变，如小鼠成纤维细胞中Dnmt3a、异染色质蛋白HP1以及甲基化DNA结合蛋白MeCP2都定位于复制晚期的异染色质着丝粒周围，而Dnmt3b则普遍存在于核内；•在胚胎干细胞中，Dnmt3a、Dnmt3b和HP1则都定位于着丝粒周围。•CpG甲基化形成机制：•甲基化酶：–Dam甲基化酶：催化GATC中的A甲基化（原核）–Dcm甲基化酶：催化CCGG中2位C甲基化（原核，JM109,HB101）–真核生物甲基化酶：CpG的C形成5‘－甲基胞嘧啶•维持甲基化酶（maintenanceDNAmethyltransferase)(dnmt1):在甲基化双链中只有亲代是甲基化的，而子代为非甲基化。此酶识别亲代甲基化位点，催化子代甲基化；对半甲基化的全甲基化催化效率非常高。一旦突变，导致全基因组去甲基化，引发胚胎死亡•重新甲基化酶（denovoDNAmethyltransferase)（dnmt3a和dnmt3b):使没有甲基化的双链发生甲基化；使早期胚胎发生重新甲基化；dnmt3b突变引发着丝粒不稳定，面部畸形和致死性免疫缺陷。甲基化与去甲基化•去甲基化：–被动途径:由于核因子NF粘附甲基化的DNA,使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化,从而阻断DNMT1的作用;–主动途径:是由去甲基酶的作用,将甲基集团移去。•甲基化与去甲基化的动态变化：–囊胚期达到去甲基化极点，着床后再甲基化；–雄原核先去甲基化，雌原核在卵裂后去甲基化；–羊在原肠前不去甲基化，原肠期达到甲基化极点，分化过程中才去甲基化。•CpG岛影响基因转录的机制–直接抑制转录复合物，如HAT（组蛋白乙酰化酶）、CA（辅助激活因子）、TF（基础转录因子）；对甲基化敏感的TF有：AP-2,E2F,NFkB;不敏感的有Sp1。–基因表达时需要核小体松散、组蛋白乙酰化，这样可以吸引HAT、CA、TF等转录因子与DNA结合而启动转录。但CpG甲基化后，结合5－甲基胞嘧啶结合蛋白（如MBD1,MBD2,MBD3T,MBD4,Mecp2等，methylcytosine-bindingdomains),激发去乙酰化酶，组蛋白恢复正常，染色体结构改变而抑制基因表达。–有些情况下，组蛋白出现去乙酰化，使得重新甲基化酶与CpG结合，引发染色体结构变化和CpG甲基化，抑制基因表达。甲基化与基因印记：•基因印记的概念：–配子或合子在发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性。既依赖于亲本起源所引发等位基因表达不对称现象。•大部分印记基因都有差异甲基化区域CpG甲基化的鉴定•免疫学法：标记可以特异性识别5m－C的抗体，测定荧光素强度（测定甲基化的含量）。•SssI甲基转移酶：测定底物（S-腺苷甲硫氨酸）剩余量来推测甲基化程度（甲基化位点的含量）•直接测序法：用亚硫酸氢钠将胞嘧啶转变成尿嘧啶，通过对特定区域进行PCR后转变成T，通过比对查找甲基化位点•酶切法：先酶切后扩增，切开了不能形成目的片段酶切消化法•两种酶切方法可以鉴定DNA甲基化–SmaI-XmaI(CCCGGG)，此序列在基因组内非常少。–HpaII-MspI(CCGG)，较为常用。•内切酶MspI可以切开是否甲基化的CCGG序列；内切酶HpaII对已经甲基化的CCGG序列不能切开，从而可以鉴定，是否甲基化。•此方法的两个缺陷：–并不是所有的CpG均在CCGG序列中，会被低估–要使用Southern杂交，比较繁琐亚硫酸氢盐法•利用亚硫酸氢盐将DNA中的胞嘧啶（C）转换成尿嘧啶（U）•结合PCR反应变成胸腺嘧啶（T）•过程：–酶切消化DNA，将2µgDNA溶于19ml水中–转换液：107µl4.04MNaHSO;3,7µl10mM对苯二酚（Hydroquinone）和6µl6NNaOH，总体积120µl,pH5.00.–将DNA溶液加入1µl6NNaOH，37°C培养15min–加入120µl转换液，95°C变性30sec，转化处理50°C转化处理15min，共计15个循环–沉淀DNA用于后续反应.甲基化特异性PCR•MethylationSpecificPCR–U转换–引物设计两对，3‘端设计到检测点：•一对检测甲基化链•另一对检测非甲基化链–放射性标记,检测•甲基化敏感引物单核苷酸延伸–U转换–PCR扩增–引物延伸标记引物末端–PCR片段有无检测COBRA方法•结合重亚硫酸氢盐的限制性内切酶法–U转换–PCR–酶切消化六、DNA的三级结构•鸟嘌呤之间的特异性相互作用造成G-四联体，四个G有序地排列在一个正方形的片层中，相邻碱基间以非正常的G-G氢键连接，形成首尾相连的环形结构，片层中间是由电负性的羰基氧组成的口袋，可以容纳一个一价的阳离子。•X光衍射技术证明，多聚鸟苷酸形成四螺旋的DNA结构，整个四链结构可以看成由多个G-四联体片层以螺旋形式堆积起来，分别来自四条多聚鸟苷酸链。螺旋的扭角为30度、螺距34A、G糖苷键为反式结构、磷酸骨架采取平行的5’-3’排列方式。图解•真核生物染色体的端粒中，有许多富含鸟嘌呤的串联重复序列：–尖毛虫端粒：d（TTTTTGGGGG）n–四膜虫端粒：d（TTGGGG）n–人类端粒：d（TTAGGG）n•这些富含G序列总是位于端粒的3’端、其5’端为富含C的序列，因此端粒在一定条件下可能采取与Poly（G）类似的四联体结构。在端粒DNA中也发现了许多G-四联体的特征•在非变性电泳中，端粒表现出很高的泳动性，表明具有很好的压缩状态；•端粒DNA特殊结构的形成也需要一价阳离子的存在；•在一定条件下，端粒DNA表现出对单链核酸酶的抗性；•核磁共振表明端粒中有G-G氢键的形成。端粒与PolyG相比又表现出新的特征•串联重复的G相互配对形成G-四联体，将导致DNA链的回折，A-T序列产生环状，缠绕在G-四联体的上下两端。由于回折，4条链的磷酸骨架出现反平行的5’-3’方向排列，从而产生反常的顺式鸟嘌呤糖苷键。不同磷酸骨架的方向、顺反糖苷键在G四联体中的分布、以及环的连接方式，都导致了多种结构异构体的产生。•除了端粒DNA以外，其他富含G的DNA序列也可能产生类似PolyG的四联体结构。如免疫球蛋白铰链区基因中富含G的部位、tRNA等，任何成串的串联重复G均可形成这种特殊结构。