药物靶标发现与筛选

药物靶标发现与筛选基因靶标核糖核酸靶标蛋白靶标一、基因靶标1、在基因数据库中搜寻药物靶标（1）表达序列标志(expressedsequencetag,EST)数据库（2）归纳逻辑设计程序EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20到7000bp不等,平均长度为360±120bp。EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。首先从样品组织中提取mRNA,在逆转录酶的作用下用oligo(dT)作为引物进行RT-PCR合成cDNA,再选择合适的载体构建cDNA文库,对各菌株加以整理,将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序,这就是EST序列的产生过程。Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016Quantitativereal-timeRT-PCRofupregulatedordownregulatedgenesrandomlyselectedfromthelibrariesofhumannormalSN(黑质)andPD'sSNCopyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016ImmunohistochemicalstainingforTHandalpha-tubulinintheSNofanMPTPmicemodelTHalpha-tubulinCopyrightrestrictionsmayapply.CelldeathactivityofdifferentiallyexpressedgenesinPDUpregulatedgenesDownregulatedgenesAminoAcidSequencesofOrexins(食欲素)andOrexinReceptors(A)Structuresofmatureorexin-Aand-BpeptidesCell1998;92(4):573-585TissueDistributionofRatprepro-orexinandOrexinReceptormRNAsACell1998;92(4):573-585Localizationofprepro-orexinmRNAandImmunoreactivePeptideinAdultRatBrainCell1998;92(4):573-585Up-Regulationofprepro-orexinmRNAinFastedRatsCell1998;92(4):573-585一、基因靶标2、基因芯片技术（1）普通基因芯片（2）ChIP-DSL（couplingChIPwithaDNAselectionandligationstrategy），芯片/DNA选择结扎技术基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNAchip），甚至蛋白芯片。INH(异烟阱)-inducedmRNAexpressionprofilesmonitoredbymicroarrayhybridizationanalysis.用INH处理INH敏感的结核菌株(红:INH处理的;绿:INH未处理的)PNAS1999;96(22):12833-12838.用INH处理INH耐药的结核菌株用乙硫异烟胺处理INH耐药的结核菌株TemporalprofileofINH-inducedexpressionofselectedgenes.PNAS1999;96(22):12833-12838.RolesofINH-inducedgenesinthecontextofaproposedpathwayformycolicacid(结核环脂酸)biosynthesis.PNAS1999;96(22):12833-12838.TheChIP-DSLschemePNAS2007;104（2):4852-4857E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857一、基因靶标3、基因敲除（knock-out)技术AninhibitoryglycinesynapseTrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286GLYT:甘氨酸酸转运子Aglutamatesynapse.TrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286GMS:修饰后的NMDA受体FlowchartoftheKnockoutStrategyCurrBiol.2005;15(18):1663-1669(18):1663-1669Deletionofmde2PermitsaStrainExpressingaRec8ProteinRefractorytoSeparaseCleavagetoUndergotheFirstMeioticDivisionwithoutPrecociousSeparationofSisterChromatidsCurrBiol.2005;15(18):1663-1669CurrBiol.2005;15(18):1663-1669Double-Strand-BreakFormationIsStronglyReducedinmde2Δ一、基因靶标4、检测报告基因把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连转导入细胞内,通过简单地检测酶活性的变化,就可以反映化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度。这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶活性的基因称为报告基因。StructureofSB247464Science.1998;281(5374):257-259ActivityofG-CSF(粒细胞集落刺激因子)andSB247464inNFS60cellluciferaseassaysScience.1998;281(5374):257-259PhosphorylationofsignalingproteinsincellstreatedwithSB247464orG-CSF.Science.1998;281(5374):257-259ThemurineG-CSFreceptorconfersresponsivenesstoSB247464.Science.1998;281(5374):257-259未转染受体转染CSF受体GranulocyticcolonyformationinresponsetoSB247464invitro.GranulopoieticactivityofSB247464invivo.Science.1998;281(5374):257-259一、基因靶标5、低等生物功能基因组筛选DrugentryrouteintoC.elegans(秀丽隐杆线虫)NatRevDrugDiscov2006;5:387-398TheserotonergicsynapseofC.elegans.NatRevDrugDiscov2006;5:387-398OverviewoftheRNAinterferencesupportedtargetidentificationprocessNatRevDrugDiscov2006;5:387-398ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419CuringofanematodeE.faecalisinfectiononsolidmediumbyantibiotictreatmentTet:四环素Cipro:万古霉素Van:环丙沙星ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419TheliquidinfectionassaygaugesdifferencesinnematodekillingduetoE.faecalisstrainswithvaryingdegreesofpathogenicityorduetoantibiotictreatment.Cyl:溶细胞素Amp:氨苄青霉素Scoringlive/deadwormsintheliquidkillingassayProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419二、核糖核酸靶标1、核酶技术核酶(ribozyme)核酶:用于描述具有催化活性的RNA,即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。●内含子(intron)内含子是基因内的间隔序列，它不出现在成熟的RNA分子中，也就是说在转录后要通过加工被切除。●外显子(exon)最后出现在成熟RNA中的基因序列。●核酶的发现:1981年，ThomasCech和他的同事在研究四膜虫的26SrRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26SrRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26SrRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。●核酶的证实为了证明这一发现，他们将编码26SrRNA前体DNA克隆到细菌中并在无细胞系统中转录成26SrRNA前体分子。结果发现这种人工制备的26SrRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。ThomasCech因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。内含子的切除:核酶的作用机理除了rRNA前体中有内含子,tRNA和mRNA前体中都有内含子的存在,这些内含子都要通过加工被切除,才能得到成熟的rRNA、tRNA或mRNA。虽然这些RNA中内含子切除的机理各不相同,但都涉及到核酶的作用。核剪接(nuclearsplicing)真核生物的结构基因中一般都含有内含子，转录后，从pre-mRNA中将内含子切除，然后将外显子重新连接成一个成熟的mRNA的过程称为RNA剪接(RNAsplicing)。鸡的卵清蛋白基因中有7个内含子，转录后需要被切除，8个外显子连接起来形成有功能的mRNA。鸡的卵清蛋白基因初始RNA转录物的剪接核酶种类:1.发卡状核酶2.锤头状核酶3.I型内含子核酶4.RnaseP核酶5.丁型肝炎病毒核酶RibozymedesignandgeneactivationNucl