RNAi、TALEN、CRISPR：一文教你做出正确选择

RNAi、TALEN、CRISPR：一文教你做出正确选择科研小助手原创，转载请注明来源。如需本文参考文献请在公众号内回复“160310”或者在文章末尾的留言区留下您的邮箱，小编看到之后会通过邮箱发给您哦~研究基因功能最常用的方法便是减少或者阻断基因的正常表达，然后进行表型分析，从而研究其功能。十几年来，RNAi一直是实验室的首选技术，其也是这一领域的王者。然而新兴技术的涌现（尤其是基于CRISPR的技术）正在逐渐瓦解RNAi的统治地位。日新月异的技术发展为生物学研究提供了越来越大的助力，但也给研究者们带来了一个有些纠结的问题，“到底应该选择那一种技术呢”。本文主要介绍了这几种技术的利弊并且教你如何正确选择适合你的技术。RNAiRNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA（antisenseRNA）的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（senseRNA）和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）引发RNAi。2000年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependentproteinkinase,PKR）和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase,2',5'-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（smallhairpinRNA,shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。1RNAi作用机制病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。2RNAi的脱靶效应Off-targeteffects（脱靶效应）最早由Dharmacon科学家Jackson和他的同事们提出（Fedorov,Y.,etal.'Off-targetingBysiRNACanInduceToxicPhenotype.'RNAAccepted(2006).）。他们给细胞转染特定基因的单条siRNA后运用全基因组芯片检测技术鉴定表达上调/下调1.5到3倍的靶基因数量。研究人员发现在这种情况下有大量的基因被非特异性的调控着。siRNA正义链和反义链与脱靶基因的互补水平有高有低，并且每条siRNA所引发的脱靶基因表达谱也不尽相同，反映了序列依靠性的脱靶效应。简单来说，Off-target效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径，通过microRNA途径，其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用，而如果进入microRNA途径，只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果，这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶。如果脱靶干扰的部分基因，正好与目的基因位于同一信号通路中，或者与目的基因的生物学功能相似，那么，如果因脱靶而干扰了其它基因，亦会造成和目的基因受到干扰后相同的细胞表型改变。而实际上，可能选择的这条shRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰，或者虽然干扰了目的基因，但是并不会引起预期的细胞表型改变。基于以上原因，自从Off-target效应被发现并被研究者们广泛认同后，越来越多的杂志要求研究者们在投稿时需要有相应的对照来说明Off-target效应。即您需要有相关对照或者实验来说明，您所获得的实验结果，不是由于Off-target效应而产生的。TALENTALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。最早关于TALE蛋白的研究始于AvrBs3，其特异识别DNA碱基的特性直到2009年才首次得到应用。该应用研究发表在Science杂志上。同年人们彻底搞清了TALE的识别规则，并且在随后的2014年CELL杂志上发表了其特异识别的原理。自TALE序列被完全解译以后，其应用逐渐普及开来。自TALEN技术正式发明以来，TALEN的特异性切割活性在酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系和体外培养细胞中得以验证。2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的Kim课题组建立了一个全基因组规模的TALEN体系。他们系统地选取了人类基因组中高度特异性的序列作为靶点以避开脱靶效应。通过高通量克隆体系，一次性构建了近2万个编码蛋白基因的TALEN质粒。这项研究中，他们以一种巧妙的方式优化了TALEN质粒的结构，以检测插入靶点后质粒对应位置上eGFP的表达的方式检测TALEN靶点插入成功率。通过研究不同间隔序列下特定靶点插入效率，从而得出最佳TALEN体系结构。2014年2月，北京大学生命科学学院魏文胜课题组依托于一种自主研发的TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作。2技术的原理与步骤TALEN技术的原理并不复杂，即通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复（HDR）或非同源末端连接途径（NHEJ）修复过程完成特定序列的插入（或倒置）、删失及基因融合（图2）。TALEN技术的核心原理就是在同一个蛋白（TALEN）上有序地实现引导进入细胞核、靶位点DNA的特异性识别和靶位点DNA的切割这三个不同的功能，这一点在上述TALEN典型结构一节中已作了较为详细的描述。在具体操作中，例如在实验室条件下，实现TALEN的关键就在于完成DNA的特异性识别功能，一般说来分为两个步骤。图3与图4分别以“铂金门”TALEN构建系统（PlatinumGateTALENconstructionsystem）和商业化的easyT体系为例，展示了实验操作中TALEN元件的构建。构建TAL靶点识别模块TAL的DNA特异性识别单位是间隔32个恒定氨基酸残基的二联氨基酸。二联氨基酸与AGCT这4个核苷酸碱基有一一对应的关系：腺嘌呤（A）由NI识别、胸腺嘧啶（T）由NG识别、鸟嘌呤（G）由NN识别，而胞嘧啶（C）则由HD识别。实验操作中，我们通过靶位点的DNA序列可以反推能特异性识别这一序列的二联氨基酸序列，从而构建TAL靶点识别模块。TAL靶点识别模块的克隆与表达根据之前对TALEN结构的介绍，我们需要将上一步骤中根据目标DNA序列构建好的一对TAL靶点识别模块与N端的核定位序列、C端的FokI酶连接起来，才能得到一个完整的TALEN元件。一般来说，我们可以采用专门用于构建TALEN的真核表达载体体系，将一对特异性的TAL靶点识别模块克隆进该载体中，再通过转染等方式导入细胞内。这种体系一般由供体质粒（donorplasmid，提供单基、二联及三联等类型的TAL模块）和骨架质粒（backboneplasmid，用于构建TALEN并表达构建好的TALEN）两类质粒构成，常用的TALEN体系有RCIscript-GoldyTALEN和pC-GoldyTALEN、TAL5-BB和pTAL6-BB及pCS2TAL3-DD和pCS2TALE-RR等。CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。1CRISPR/Cas系统元件与特征CRISPR/Cas系统最早是在细菌的天然免疫系统内发现的，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大学（OsakaUniversity）的研究人员在E.coliK12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR），其结构如图5所示，目前普遍认为有40%的细菌基因组具有这样的结构。其实小编最后想说一句，只有最适合自己和实验的技术才是最好的技术，并不一定要用到最新最高大上的技术，所以各位也不用刻意追求使用这些最新最前沿的技术，但是了解一下总是好的，万一以后用着了呢=_=！参考文献：1.BoettcherM,McManusMT.ChoosingtheRightToolfortheJob:RNAi,TALEN,orCRISPR.Molecularcell2015;58:575-585.2.LaganaA,ShashaD,CroceCM.SyntheticRNAsforGeneRegulation:DesignPrinciplesandComputationalTools.Frontiersinbioengineerin