如何发现药物新靶标

如何发现药物新靶标文献综述摘要：药物靶标的发现是创造新药物的前提，也是药物筛选的基础，本文从有效单体化合物、基因表达差异、蛋白质表达差异、蛋白质相互作用和RNA干扰方面着手总结了一些药物新靶标的发现技术进行了综述。关键词：药物靶标；基因表达差异；差异蛋白质组学；蛋白质相互作用；RNA干扰引言：药物靶标是药物作用而实现疗效的目标分子，靶标的发现是药物创新的前提，也是药物筛选的基础。新靶标的发现对于更优良的创新型药物的开发具有重大的促进作用。例如，利用HMGCoA还原酶作为药物靶标开发了一系列他汀类降脂药物，仅2000年,该类药物的销售额达120亿美元,并以每年15%～20%的速度增长。Novartis公司利用慢性粒细胞性白血病(CML)相关蛋白Bcr-Abl为靶标，在短时间内开发出有效治疗CML的新药—高活性Bcr-Abl激酶抑制剂STI571(Gleevac)。【1】从这些例子可以发现，生物医药公司花费大量的物力和财力寻找药物的新靶标。随着生命科学的发展，各种科技的创新，也出现了很多药物靶标的发现技术。一、从有效单体化合物着手发现药物靶标以疗效确定的单体化合物（天然产物或现有药物）为探针，然后利用计算机模拟单体分子与相关蛋白质三维结构及其相互作用，找到所有的能与其特定结合的蛋白质，这些蛋白质可能与活性药物单体发挥作用的机制相关，因此是潜在的药物靶标分子。蒋华良等便是用此方法发现了2个抗幽门螺旋杆菌活性的药物的作用靶标蛋白def和TyX，并测定了def蛋白复合物的晶体结构。张永清【2】等利用基因芯片研究苦参碱诱导白血病K562细胞基因表达谱改变，发现CCNB1，cyclinD1，PCNA等基因表达发生明显改变，这些基因可能是苦参碱作用靶点之一。Chen【3】等也利用这个方法研究阿霉素处理MCF-7细胞后蛋白质表达的改变，发现阿霉素造成MCF-7细胞中热休克蛋白27(Hsp27)的3个异形体表达显著下降，由此推测Hsp27可能是控制乳腺癌生长的一个潜在药物靶标。二、以正常组织与病理组织基因表达差异发现靶标基因在不同组织和疾病发生发展的不同时空存在着明显的基因表达差异，表达明显发生变化的基因常与发病过程及药物作用途径密切相关，这些表达异常的基因很有可能是药物作用的靶点，可作为潜在的筛选药物的靶标【4】。基因芯片技术、mRNA差异显示技术、抑制性消减杂交技术和基因表达系列性分析技术等在现代生命科学研究中使用也日益广泛，这些技术在新的药物靶标的发现中同样扮演了重要的角色。Heller【5】等利用基因芯片技术分析了正常及诱发病变的巨噬细胞、软骨细胞系、原代软骨细胞和滑膜细胞的mRNA，发现了数种变化明显的基因，其中包括基质金属弹性蛋白酶基因，为治疗类风湿关节炎提供了新的药物靶标。Kapp【6】等利用该技术分析了霍奇金病细胞系中950个基因的表达情况，并与EB病毒永生化的B淋巴细胞系LCL-GK的基因表达谱相比较，发现白细胞介素-13及其信号转导通路可能成为治疗HD新的药物靶标。Yamamoto【7】等通过基因表达系列性分析技术分析Hela细胞中基因的表达模式，发现了许多高表达的基因，同时也发现了许多新的肿瘤特异性基因，这为肿瘤的治疗提供了新的靶标。Ryo【8】等利用该技术研究HIV-1病毒感染人T细胞株MOLT-4后基因表达模式变化，发现了53个发生显著表达变化的基因，这为艾滋病的研究提供了重要的线索。Fisher【9】等将mRNA差异显示技术用于乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞的对比研究中，发现周期蛋白D2在癌细胞中表达下降，并且进一步实验，结果暗示了周期蛋白D2基因可能是5-氮杂胞苷治疗乳腺癌的一个靶基因。Violette【10】等用该技术比较药物敏感的结肠癌细胞系HT-29与其耐药的3个子细胞系的基因表达，发现RegIV基因在耐药的肿瘤细胞系中高度表达，而在敏感细胞系中表达水平很低，深入研究RegⅣ基因的功能有可能发现新的治疗结肠癌的方法。Uekawa【11】等通过抑制性消减杂交技术研究与老鼠胚胎成纤维细胞衰老相关的基因，检测到TARSH基因在正常肺中高表达，而在一些肺癌细胞系中表达显著下降。由此推测TARSH基因可能能够抑制肿瘤发生。刘海燕【12】等人通过SSH技术发现了许多与肿瘤血管生成相关的基因，深入研究这些基因有可能为抗血管形成治疗肿瘤提供了有价值的靶标。三、通过定量分析和比较研究在正常和疾病状态下蛋白质表达谱的改变发现靶标与基因的表达类似，同一细胞在不同的生理和病理环境中，其蛋白质表达谱也会发生改变。因此，通过对比研究正常细胞和疾病细胞的蛋白质表达谱的变化，来寻找与疾病相关的蛋白质，这些相关蛋白经研究筛选后可能成为治疗某种疾病的新靶点。常用的技术包括蛋白质芯片技术、二维凝胶电泳技术、同位素亲和标签技术、双向荧光差异凝胶电泳技术以及它们和质谱鉴定的有机结合。利用蛋白芯片技术，Senior【13】等检测了来自于健康人和前列腺癌患者的血清样品，在短短的三天内发现了6种潜在的治疗前列腺癌的药物靶标。Freedland【14】等发现中性肽链内切酶表达量的缺失或减少在前列腺癌的早期阶段时常发生，暗示了CD10可以作为前列腺癌早期治疗的新靶标。Schumacher【15】等应用同位素亲和标签技术研究HSP90抑制剂GA处理ALK-(+)ALCL细胞系后蛋白质表达谱变化，共识别了176个不同表达的蛋白质，在GA处理的细胞中49个蛋白质表达上调1.5倍，70个蛋白质表达下调1.5倍或更多。马学玲【16】等应用双向荧光差异凝胶电泳技术比较大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)6h病灶侧大脑皮层和正常大鼠相应部位蛋白质变化，发现a-微管蛋白表达量在脑缺血组较正常组明显减少，因此推测缺少微管蛋白将导致脑的结构和功能改变，提示a-微管蛋白有可能成为治疗缺血性脑血管病的新靶点。四、以蛋白质相互作用为基础发现药物靶标人类许多疾病如癌症、自身免疫性疾病和病毒性传染病都是因为蛋白质-蛋白质相互作用的错误或短缺造成的，因而通过揭示疾病蛋白与其它蛋白的相互作用可以发现新的药物靶标。研究蛋白质相互作用常用的方法有酵母双杂交技术、噬菌体展示技术、表面等离子共振技术、串联亲和纯化技术和双分子荧光互补技术。Vasudevan【17】等通过酵母双杂交技术研究发现了登革病毒中依赖RNA的RNA聚合酶(NS5)和病毒旋转酶(NS3)相互作用的区域，还发现NS5和新的蛋白质细胞核转运体importin-beta之间也发生相互作用。以它们相互作用的共同区域作为药物作用的靶标,能够通过阻止病毒的复制而治疗疾病。黄英【18】等应用T7噬菌体展示技术，以HCV的核心蛋白作为靶分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选。确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为SIP1(Smadinter-acting-protein)，这为进一步抗HCV感染的预防和治疗提供了新的靶位。Guermazi【19】等通过SPR技术证明，系统性红斑狼疮患者低水平的蛋白S(PS,一种抗凝因子)是由于自身免疫机制引起的，揭示了SLE患者血栓形成的机理。王芹【20】等将SPR和质谱技术结合起来，研究发现SARS-CoV核蛋白与人胚肺二倍体细胞(2BS)和人肺癌细胞系A549中的细胞蛋白26S蛋白酶调节亚单位S10b(简称p42)相互作用。继续深入研究这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS-CoV的发生发展中发挥的作用，有可能为治疗该疾病提供有价值的靶标。五、应用RNA干扰技术特异的抑制细胞中不同基因的表达，通过细胞的表型变化发现靶标Ngo【21】等应用RNA干扰文库研究活化和生发中心的弥漫大B细胞淋巴瘤，发现在活化的B细胞样DLBCL中，CARD11是调节IkB激酶活性的上游信号分子，这些研究有助于揭示不同于已知致癌基因的新治疗靶标。Zhao【22】等应用RNA干扰文库识别了53个内生的成骨抑制子，这对于骨疾病的治疗具有重要的意义。值得注意的是RNA干扰技术并不是完全的靶特异性，有时也会产生脱靶效应，但实践证明它在靶标发现方面具有广阔的应用前景。六、总结通过上述技术，人们可以更加方便的发现药物的潜在靶标，靶标的发现无疑是对新药的研发起了促进作用。参考文献：[1]陈国强，徐娅蓓，郭萌.药物靶标和创新药物:机遇与挑战[J].国外医学·生理、病理科学与临床分册，2004，24(3):205.[2]张永清，黄高升，刘红娟等.基因芯片研究苦参碱诱导K562细胞基因表达谱变化[J].第四军医大学学报，2004，25(6):封2-01.[3]ChenST,PanTL,TsaiYC,etal.Proteomicsrevealsproteinprofilechangesindoxorubicin—treatedMCF-7humanbreastcancercells[J].CancerLett,2002,181(1):95.[4]刘二伟，葛长荣等.生物芯片技术在中药新药开发中的应用前景[J].中国兽药杂志，2006，40(9):45.[5]HellerRA,SchenaM,ChaiA,etal.Discoveryandanalysisofinflammatorydisease-relatedgenesusingcDNAmicroarrays[J].ProcNatlAcadSci,1997,94(6):2150.[6]KappU,YehWC,PattersonB,etal.Interleukin13issecretedbyandstimulatesthegrowthofHodgkinandReed-Stern-bergcells[J].JExpMed,1999,189(12):1939.[7]YamamotoM,WakatsukiT,HadaA,etal.Useofserialanalysisofgeneexpression(SAGE)technology[J].JImmunolMethods,2001,250(1-2):45.[8]RyoA,SuzukiY,IchiyamaK,etal.SerialanalysisofgeneexpressioninHIV-1-infectedTcelllines[J].FEBSLett,1999,462(1-2):182.[9]FischerH,ChenJ,SkoogL,etal.CyclinD2expressioninfamilialandsporadicbreastcancer[J].OncolRep,2002,9(6):1157.[10]VioletteS,FestorE,Pandrea-VasileI.RegIV,Anewmemberoftheregeneratinggenefamily,isoverexpressedincolorectalcarcinomas[J].IntJCancer.2003,03(2):185.[11]UekawaN,TerauchiK,NishikimiA,etal.ExpressionofTARSHgeneinMEFssenescenceanditspotentialimplicationinhumanlungcancer[J].BiochemBiophysResCom-mun,2005,329(3)∶1031.[12]刘海燕，胡东，冉宇靓等.抑制消减杂交分离肿瘤血管生成相关基因[J].中国生物化学与分子生物学报,2005,21(1):120.[13]SeniorK.Fingerprintingdiseasewithproteinchiparrays[J].MolMedToday,1999,5(8):326.[14]Freed,SeligsonDB,LiuAY,etal.LossofCD10(neutralendopeotidase)isafrequentandearlyeventinhumanprostatecancer[J].Prostate,2003,55(1):71.[15]Freed,SeligsonDB,LiuAY,etal.Proteo