动态光散射

1Beijing2009光散射及相关技术在高分子表征中的应用兰晶WyattTechnologyCorporation主要内容多角度激光光散射技术WyattTechnology公司介绍光散射的发展及基本理论为什么需要多角度?静态光散射在高分子表征中的应用BatchmodelvsOnlinemodel动态光散射在高分子表征中的应用BatchmodelvsOnlinemodelQuestions3公司简介由Dr.PhilipJ.Wyatt于1982创建致力于光散射应用于液相系统的世界上最大的独立公司仅美国员工超过70人；遍布世界20多个国家和地区的代表处超过5660篇知名同行评审的文献出版资料超过50项美国及其他国家的专利，还有很多正在申请中......4关于创始人Dr.PhilipJ.Wyatt…70年代晚期~80年代初组建第一个将激光装置用于科学研究的公司第一个将主板CPU引入科学仪器仅光散射相关的专利超过30项公开发表与光散射研究相关的SCI文章超过50篇5主要产品DAWNHELEOSII(18-anglestaticLSinstrument)miniDAWNTREOS(3-anglestaticLSinstrument)OptilabrEX(differentialrefractometer)ViscoStar(viscometer)DynaProTitan(dynamiclightscatteringinstrument)DynaProPlateReader(automatedDLS)EclipseF(asymmetricfieldflowfractionator)**ManufacturedbyWyattTechnologyEurope.6光散射发展历程18502006LordRayleigh(1842-1919):研究了小粒子光散射现象，发现并解释了散射光强度与波长的依赖性，即散射光强度与波长4次方成反比。JamesClerkMaxwell(1831-1879):统一了电磁场理论，并预测光是一种电磁波。AlbertEinstein(1879-1955):解释了纯溶剂的光散射是由溶剂分子的密度涨落引起的。ChandrasekharaV.Raman(1888-1970):研究了溶液的热动力学以及与光散射相关的各种物理性质，解释了为什么海水是蓝色。BrunoZimm&WalterStockmayer:高分子物理大师7什么是光散射?Innature…blueskyandcloudsredsunsets8什么是光散射?Inthelab…10光散射如何产生?光与粒子接触，引起粒子极化受极化的粒子产生散射光粒子受极化产生偶极的大小，以及散射光的强度大小取决于粒子的极化率（Polarizability）11Copyright2008AllRightsReserved折射率n极化率直接与物质的折射率有关折射率的计算方法如下.在溶液中，极化率可以用折射率增量来表示，dn/dc.nvacuumliquidvv2scattereddcdnIdcdnEscattered19光散射基本方程K*=4p2(dn/dc)2n02/(NAl04)n0：溶剂绝对折射率.c：溶液浓度(g/mL).R(q)：过剩瑞利值NA：Avogodro常数.l0：入射光在真空中波长.dn/dc：折射率增量Mw：重均分子量K*cR(q)1MwP(q)+2A2c=20rIIRqq20光散射的基本原理Principle1散射光强度正比于分子量、浓度、折光指数增量的平方Principle2角度的变化直接与分子尺寸有关21多角度激光光散射法入射光光电二极管检测器透射光22为什么需要多角度?•更高的精确度•剔除差的色谱结果•通用性宽广的应用范围蛋白质粒子支化度聚集态23PullulanP400PoorChromatography90°AUXElutionvolumeScatteringAngle24PullulanP400PoorChromatography25为什么测的是绝对分子量?•无需分子参考标样•所有参数为直接测定折射率池子几何形状及二极管检测器波长样品浓度温度dn/dc值•无需假设分子分子模型或构象26主要内容多角度激光光散射技术WyattTechnology公司介绍光散射的发展及基本理论为什么需要多角度?静态光散射在高分子表征中的应用BatchmodelvsOnlinemodel动态光散射在高分子表征中的应用BatchmodelvsOnlinemodelQuestions27BatchModel:ZimmPlotConfidentialCopyright2007AllRightsReservedMw=(7.3±0.8)e+6g/molRg=162±8nmA2=(1.2±0.2)e-4molmL/g²28-2.00.02.04.06.00102030Detector:11Volume(mL)Baselines-MHCHSP1010020030040050000.20.40.60.81Mw[kD]Concentration[mg/mL]C1C2C3C4ProteinOligomericStateatDifferentConcentrationBatchModel:DebyePlot29体积排阻色谱（SEC）30传统SEC假设的缺点Sizeexclusionchromatographyofnativeandreduced,carboxymethylatedRNaseAdaptedfrom“Size-exclusionchromatographywithon-linelight-scattering,absorbance,andrefractiveindexdetectorsforstudyingproteinsandtheirinteractions”byJ.Wen,etal.,Anal.Biochem.240155–166(1996).传统SEC假设:样品的洗脱性质必须与标样相近Copyright2008AllRightsReserved32传统SEC假设的缺点-0.10.00.10.20.381216202428RIsignal(volts)Volume(mL)Chromatograms10____01PSA___01BranchedMw(SEC)=287,000Mw(SEC-MALS)=371,000LinearMw=330,000传统SEC测定支化分子的分子量偏小33___Polystyrenestandards___unknownpolymer为什么传统SEC不能准确测定分子量？___Polystyrenestandards___unknownpolymer一定的流体力学体积具有相同的半径光散射法证明了不同分子量的高分子可能具有相同的流体力学半径34典型光散射与色谱联用配置35OnlineModel：SEC-LS-RICopyright2008AllRightsReserved葡聚糖：Mw=(4.861±0.15)e+4g/mol；OnlineModel：3.061e+4g/mol36聚集体检测-0.10.00.10.20.30.40.54.06.08.010.012.014.0AUX,90?DetectorVolume(mL)PeakID-VIAL__1090?AUX1LS信号对大分子物质敏感.RI丙烯酰胺乳化共聚物LS-RI色谱图37ConfidentialCopyright2006AllRightsReservedOnlineModel:DebyePlotOnedataslice38OnlineModel：SEC-LS-RI利用MW、Rg值判断高分子在溶液中的构象棒状分子:斜率1球型分子:斜率1/3无规线团:斜率0.5~0.6rod(slope=1)Sphere(slope=1/3)randomcoil(slopenear0.5–0.6)rgMloglog39linearbranchedormorecompactstructuregrgrgMbranchedlinearM22支化度测定OnlineModel：SEC-LS-RI40SECcolumn•与色谱检测器联用•直接测定增比粘度:•利用特性粘度计算流体力学半径:•确定Mark-Houwink常数，建立方程。OnlineModel：SEC-LS-Vis41工作原理简介…4CapillaryBridgeDesign42如何测定特性粘度？SpecificViscosityIntrinsicViscosityspConcentration与分子的尺寸、形状有关43特性粘度如何计算RhMark-HouwinkEquationEinstein-SimhaRelation指数a与高分子的构象有关44范例：40kD葡聚糖（Dextran）45Mark-Houwink-Sakuradaa=0.522±0.001a=0:solidspheresa=0.5:linearrandomcoilsinthetaconditionsa~0.5-0.8:linearpolymersinagoodsolventa~1.8-2:rigidrodViscometryofPolymersandPolyelectrolytesW.-M.KulickeandC.ClasenSpringer-VerlagBerlinHeidelberg,200447OnlineModel：SEC-LS-RI-UV糖蛋白膜复合膜蛋白嵌段聚合物多角度激光与UV联用表征：48对于改性蛋白，例如复合膜蛋白、糖基化蛋白、嵌段聚合物等xprotein蛋白质量分数OnlineModel：SEC-LS-RI-UV理论49膜蛋白具有单分散性BSAmonomer,67kDComplex,84kDDetergent,35kDCoremembraneprotein,49kDCopyright2008AllRightsReserved50主要内容多角度激光光散射技术WyattTechnology公司介绍光散射的发展及基本理论为什么需要多角度?静态光散射在高分子表征中的应用BatchmodelvsOnlinemodel动态光散射在高分子表征中的应用BatchmodelvsOnlinemodelQuestions51动态光散射测定那些参数?•分子量,Mw•分子尺寸,Rg•第二维利系数,A2•平移扩散系数，Dt•流体力学半径，RhStaticLightScatteringDynamicLightScattering52半径比较静态光散射(SLS):均方根旋转半径，Rg–质心半径–检测下限10nm动态光散射(DLS)流体力学半径，Rh–与样品分子具有相同扩散系数的等效球体半径.–检测下限~0.5nmRh53构象:Rhvs.Rgsolidsphere3-armstarpolymer54范例：Rh与分子形状RhRhRhH2OH2OH2O+++H2OH2O++55动态光散射研究分子运动Brownian运动引起光散射强度的波动ConstructiveinterferenceDestructiveinterference56光强度的波动与分子尺寸相关在相同时间内，分子尺寸大的粒子引起光强度波动较小粒子慢57光强度波动分析自相关函数光强度波动58光强度波动分析自相关函数光强度波动59自相关函数Rh=9nmlatexspheresqLaserSample自相关函数方程:I0ISScatteringvector:Dt:Diffusioncoefficient60运动的时间尺度如何由扩散系数计算Rh?kB–Boltzmann’sconstantT–temperature(Kelvin)η–viscosityofs