淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60℃保温15min可使其钝化。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在60℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。1酶活测定方法（1）标准曲线的制作(见下表)①取7支20ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20ml,以1号管作为空白调零点,在520nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。试剂1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力测定①待测粗酶液的制备：发酵24h后发酵液4000r/min离心10min,去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步表1标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值纯化的淀粉酶。②按以下顺序操作：取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1ml于各只试管中，于60℃水浴中预热5min柠檬酸淀粉缓冲液同时在60℃水中预热5min，→取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入试管中,于60℃水浴中保温30min→加入1.5ml3,5-二硝基水杨酸,沸水中5min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至20ml。→摇匀,用分光光度计测定OD520nm值。在上述条件下以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力酶活力测定公式：淀粉酶活力=麦芽糖含量（mg）·淀粉酶原液总体积（mL）/所加淀粉质量每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：表2样品酶活力测定步骤反应顺序样品（重复3个）样品空白标准空白样品稀释液（ml）110蒸馏水00160℃预热5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60℃保温30min依次加入DNS试剂（ml）1.51.51.5混合100℃煮沸5min加入0.4mol/LNaOH溶液终止反应加入蒸馏水至总体积（ml）202020反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计520nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。2活性计算酶活力单位定义：在60℃、PH5.6条件下，每小时从2％的可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）淀粉酶活性U按下式计算：U=×F其中：U——样品淀粉酶活性，U/ml；K×（A－A0）S×（30÷60）×180K——标准曲线斜率；F——样品溶液反应前的总量，ml；S——样品测试量；表1中S＝1ml；60——1小时为60min；30——反应时间，min。试剂(1)2%淀粉溶液(2)0.4mol/L氢氧化钠(3)pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。(4)3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml，盖紧瓶塞，防止CO2进入。