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1第一节微生物的生长繁殖1.微生物生长繁殖的概念：略2.研究微生物生长的方法：分批培养与连续培养分批培养：在一个密闭系统内投入一定的营养物质，接入少量菌种进行培养，在特定条件下完成一个生长周期。连续培养：以一定的速度向培养系统内添加和流出培养液体，以维持培养基成分的恒定或菌体浓度的恒定，使微生物能连续不断地生长繁殖。23细菌的数量很大，纵轴0-10代表100-10103.微生物分批培养生长曲线:停滞期、指数期、静止期和衰亡期6个时期？4Ⅰ停滞期（lagphase)（1）特征：数量不变甚至减少；但代谢活跃，体积、重量增加。（2）原因：适应环境(合成相应的酶)，进行营养储备。（3）影响因素：接种量、菌龄、营养。如蓝细菌的培养。(4)应用：在实际工作中，停滞期的出现会增加操作时间，降低工作效率。应对措施：接种对数期的菌种、增大接种量、保持接种前后的培养介质和条件一致等。5Ⅱ指数期（exponentialphase）X=X0*2n练习：计算代时:10h,103-109（1）特点：生长快、成分均匀、酶活力高、代时短。（2）代时：G6（3）影响代时的因素：菌种、营养条件、环境条件等.如大肠杆菌在20℃,代时是35℃时的2倍；伤寒杆菌在含蛋白胨分别为0.125％和1.0%的培养基中的代时分别为800min和40min.7若以大肠杆菌每20min分裂一次的速度计算，一个细胞连续分裂48ｈ，即144代之后，可以产生2144个子细胞，其质量将超过2.2×1025吨，约为地球质量的3680倍！8Ⅲ静止期（stationaryphase）（1）特点：细胞数目和重量均达最高点。（2）原因：营养耗尽或比例失调、有害代谢产物积累、pH、氧化还原电位等条件恶化。（3）应用：静止期是菌体或代谢产物（如单细胞蛋白、乳酸等）的最佳收获期。9Ⅳ衰亡期（declinephase或deathphase）（1）特点：繁殖数死亡数，细胞自溶或形成芽胞。（2）影响因素：环境不利，分解代谢合成代谢。如果将分批培养的系统看作是一个生态系统的话……10人类群体有类似规律吗？如果把地球看作是封闭的培养系统（海洋是液体培养基，陆地是固体培养基、沼泽是半固体培养基），人类看作是细菌，人口增长和环境污染若不加控制，必将经历类似的四个阶段，最后，由于资源枯竭，污染物遍地而引发大灭绝！！自救措施：——节约、节育(防止营养物消耗过快)；——环保(防止有害代谢物的抑制)但愿不是分批培养！但愿是连续培养！114.微生物的连续培养12•恒浊器：按培养目的确定浊度，并借光电控制系统调节进水、出水量，维持细菌浓度,即浊度的恒定。此法一般用于菌体生产及与菌体生长平行的代谢产物的生产，从而获得更好的经济效益。•恒化器：同速进水和出水，维持培养液的成分恒定。常通过控制培养基中的生长限制因子，使细菌的比生长速率处于需要的水平。此法尤其适用于污废水的处理。1314细菌生长曲线在废水生物处理中的应用常规活性污泥法：静止期生物吸附法：静止期高负荷活性污泥法：对数期延时曝气法：衰亡期155.微生物生长量的测定方法（1）测定细菌总数：血球计数板、染色涂片、电子计数器、比浊法测定。（2）测定活细菌数：稀释培养、过滤计数、菌落计数。（3）计算生长量：细胞干重法、氮含量测定法、DNA测定法、生理指标法。16血球计数板法17原理：将1mm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如霉菌孢子、酵母菌等，不适用于细菌等个体较小的细胞。特点：快速，准确，但测定结果为菌总数，一般不能区分活菌和死菌。18（1）16×25规格的计数板计数方法菌液稀释倍数个小格内细胞数＝细胞数100004008080ml/菌液稀释倍数个小格细胞数＝细胞数10000400100100ml/（2）25×16规格的计数板19取0.01mL细菌悬液涂布于刻有1cm2面积的计数板上，在显微镜下观察几个视野的细菌数，按下式计算每毫升原液的细菌数：染色涂片法菌液稀释倍数一个视野的细菌数视野面积＝细胞数100cm1mL/220MPN法：mostprobablenumber，即最大可能数目。适宜于对生长较慢的细菌计数。稀释培养后根据阳性管的数目查表获得MPN.稀释培养计数过滤培养计数适宜于含菌较少的水样，用0.45µm滤膜过滤后将滤膜平板培养基上，得到菌落后计数。21CFU法：colonyformunit，即菌落形成单位，计算单位体积细菌悬液在平板培养基上的菌落数。PFU??菌落计数菌液稀释倍数接种量培养皿中的平均菌落数＝细胞数mL/计算：3个平板接种稀释度为10-3的样品各0.5mL，培养后的菌落数分别为50、60、70，求原液的细菌浓度。22第二节微生物的生存因子1.温度2.pH3.氧化还原电位4.溶解氧5.太阳辐射6.水的活度与渗透压7.表面张力231.温度对微生物生存的影响•生长温度的三基点：最低点、最适点、最高点.•废水中的细菌：一般都是嗜中温菌，最适温度多在30℃左右，嗜冷菌和嗜热菌占少数。P175表5-624Tem.Bac.Minimum(℃)Optimum(℃)Maximum(℃)Psychrophile-5-05-1020-30Mesophile5-1025-4045-50Thermophile3050-6070-80Extremethermophile5570-105110-11325极地雪藻西瓜雪（Watermelonsnow）又称作“雪藻”，是一种具有粉红颜色并带有新鲜西瓜气味的雪。常在晚春或初夏出现在世界各地的高山和极地地区。由一种嗜冷的极地雪藻（绿藻）引起，含虾青素和叶绿素。26•高温杀菌的机理：1）蛋白质、核酸变性；2）脂类溶解，细胞膜溶解,结构解体。3）一般来说无芽孢的细菌在水中加热到100℃迅速死亡。炭疽芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌枯草芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌灭菌温度(℃)105100100120灭菌时间(min)5-1066-71227蜡状芽孢杆菌28（1）范围：细菌、放线菌一般要求中性偏碱，而酵母菌、霉菌一般要求偏酸的环境。可生存的pH范围在4-10.(2)影响：影响膜结构及酶活性、营养物的解离与吸收。（3）维持：由于细胞膜的屏蔽、磷酸盐缓冲作用等因素，细胞内pH一般都保持中性。（4）应用：对污(废)水有净化功能的微生物适应pH变化的能力比较强，pH在6.5-8.5可不调节。P177表5-8嗜酸微生物中的氧化硫硫杆菌等与铀矿冶酸性废水的处理关系密切！2.pH对微生物生存的影响29pH的变化与调节另外：可用缓冲溶液或以碳酸钙作为备用碱调节pH值。加糖类、油脂等。过碱时：降低通气量或蛋白质等。加适当氮源，如过酸时：提高通气量或“治本”中和过碱时：加中和过酸时：加“治标”调节措施,,,NapH3423NaNOHClSOHNaCOOH303.氧化还原电位对微生物生存的影响（1）概念：某物质与氢电极构成原电池时的电压高低,反映氧化性强弱。+820mV（充满O2的环境），-400mV（充满H2的环境）。(2)影响因素：主要是氧化剂(氧气等)与还原剂(有机物、H2S等)的含量。（3）不同细菌适宜的氧化还原电位：好氧细菌：＋300mV～＋400mV、专性厌氧细菌-200mV～-250mV、兼性厌氧细菌以＋100mV为分界线。（4)调节方法：改变曝气强度或添加还原剂，如VitC、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫化氢、金属铁等。好氧活性污泥法应将Eh控制在＋200mV～＋600mV,厌氧污泥法应控制在-100mV～-200mV.314.氧气对微生物生存的影响（1）分类：P179SOD?CAT?1个大气压=1.01*105Pa专性好氧微生物：0.21*101kPa，多数微生物。微量好氧微生物：0.003-0.2*101kPa耐氧厌氧微生物：氧对其不产生毒害作用。兼性厌氧微生物：有氧无氧均能生存,如酵母菌、反硝化细菌等.专性厌氧微生物：0.005*101kPa，如产甲烷菌等。（2）应用：好氧生物处理中要有充氧设备。专性厌氧微生物在培养时,可用氦气、氢气、氮气等驱赶氧气后置于无氧培养罐内培养,或与兼性厌氧的微生物混合培养。32好氧兼性厌氧微量好氧专性厌氧335.水的活度和渗透压对微生物生存的影响(1)水的活度(aw)：在一定温度和压力下，溶液的蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压（取1.00)之比.aw表示环境中水的有效性。一般细菌酵母菌霉菌嗜盐菌嗜盐真菌嗜高渗酵母0.910.880.800.760.650.60（2）渗透压：不同溶液被半透膜隔离开时，两侧水分子浓度差形成的压力。10%NaClNaCl起始状态动态平衡状态10%渗透压34•渗透压可影响细菌生存：0.85％的NaCl溶液常作为细菌的等渗液。在高渗、低渗溶液中，细菌将分别失水和吸水，导致质壁分离或细胞胀大。•（3）应用：防腐：如用5%-30%的盐水腌咸菜、咸鱼，用60%-80%的糖溶液做蜜饯等。高含盐废水难于生物处理，应冲稀后处理或对细菌基因改造。35第三节其他环境因子对微生物的影响1.紫外辐射与电离辐射2.超声波3.重金属4.极端温度5.极端pH6.干燥7.某些有机物8.抗生素361.辐射对微生物的影响（1）紫外辐射：紫外线的波长范围：200-390nm,UVC,B,A的波长：200－290－320－390nm，260nm左右杀菌力最强。杀菌机理：引起核酸和蛋白质变性，二者的吸收峰分别是260nm和280nm.一般细菌在照射5min即能被杀死(G-更敏感)，芽孢则需10min.应用：紫外灯能发出253.7nm的紫外线，由于穿透能力很弱，多用于空气消毒和表面消毒，剂量：30W,20-30min,亦可用于诱变育种、饮用水消毒、污废水消毒等。37无菌操作台3839（2）电离辐射：X-射线和γ射线等。来源：铱等放射性元素可产生X-射线(0.1-0.01nm),钴、镭等可产生γ射线（0.01-0.001nm)。杀菌机理：低剂量(0.93-4.65Gy)有促进生长或变异的作用,高剂量(900Gy)对微生物有致死效应，高能量激发水分解产生O·自由基或H2O2等强氧化剂使蛋白质变性(-SH很敏感).应用：可用于微生物的诱变育种。40Gy：1kg被辐照物质吸收1焦耳的能量为1戈瑞(Gy).Sv：1kg人体组织吸收1焦耳为1西弗(Sv).西弗是个非常大的单位，因此通常使用毫西弗、微西弗。对日常工作中不接触辐射性工作的人来说，每年的天然辐射为1000~2000微西弗。一次小于100微西弗的辐射，对人体无影响。与放射相关的工人，一年最高辐射量为50000微西弗。一次性遭受4000毫西弗会致死。412.超声波对微生物的影响超声波指超过人的听觉能力上限(20KHz)的声波。杀菌机理：使细胞内胶体沉淀，并使细胞空穴化而死亡。应用：超声波破碎仪用于破坏细胞，提取活性物质。空气和水的消毒、仪器清洗等。423.重金属对微生物的影响（1）杀菌机理：与蛋白质或酶的-SH结合，使之沉淀变性。（2）应用：升汞（HgCl2）对大多数细菌有致死效应而用于灭菌；硫酸铜是良好的杀菌剂和杀藻剂。常用硫酸铜与石灰配制成的波尔多液，在农业上用于防治某些植物病毒。在远距离取水样作检测时，一般1L混合液中加10ml质量浓度为1g／L的硫酸铜，可抑制微生物的呼吸，尽量使水质保持不变。434.极端温度对微生物的影响（1）灭菌与消毒（2）干热灭菌与湿热灭菌：湿热状态下蛋白质易凝固,热蒸汽的穿透力强，且蒸汽有潜热存在，所以湿热灭菌效果好。44165857756020406080100120140160180018%25%50%凝固温度℃蛋白质含水量45巴斯德及巴斯德消毒法常用的灭菌方法46灼烧灭菌47灭菌锅48卧式灭菌锅49干热灭菌箱50巴斯德消毒高温灭芽孢515.极端pH对微生物的影响（1）影响微生物表面的电荷及培养基中营养物质的存在状态，从而影响微生物对